外周血造血干細(xì)胞凍存保護(hù)劑的研究.pdf

1、背景
　　 造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是目前治療多種惡性/難治性血液病、實(shí)體瘤、免疫缺陷病和嚴(yán)重放射病的有效方法。此外,造血干細(xì)胞在組織工程、再生醫(yī)學(xué)、基因治療等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用方興未艾。為滿足研究和應(yīng)用的需求,深低溫條件下長期保存造血干細(xì)胞是非常必要的。有效的保護(hù)劑及其合適的濃度與最佳升降溫速率相結(jié)合,才能做到對造血干細(xì)胞的深低溫長期保存,并保持其

2、活力和其他生物學(xué)特性。有效的凍存保護(hù)劑是保持造血干細(xì)胞低溫保存復(fù)蘇后活力的一個(gè)基本條件。
　　 長期以來,國內(nèi)外科學(xué)家對外周血造血干細(xì)胞(peripheral blood stem cells,PBSC)的低溫保護(hù)劑進(jìn)行研究,不斷改進(jìn)保護(hù)劑的組合和種類。海藻糖是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖,廣泛存在于海藻、酵母、霉菌、食用菌等生物體內(nèi),無毒副作用,在體內(nèi)可被酶水解成為葡萄糖而利用。海藻糖化學(xué)性質(zhì)十分穩(wěn)定,除了具有低聚糖的一般特性,還具

3、有抗高溫、抗寒及穩(wěn)定細(xì)胞膜等作用,在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境下,能夠在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜,從而對生命體和生物大分子起到良好的非特異性保護(hù)作用。海藻糖具有保護(hù)生物細(xì)胞和活性物質(zhì)在低溫、干燥等不良環(huán)境下活性不受破壞的獨(dú)特生物學(xué)性質(zhì),日益受到人們重視,正在深入研究其對人類細(xì)胞冷凍或冰凍干燥保存的保護(hù)作用。
　　 納米技術(shù)是指在納米尺度(1-100nm)下對物質(zhì)進(jìn)行制備、研究和工業(yè)化的一門綜合性的技術(shù)。納米材料以

4、其小尺寸和高比表面效應(yīng)在醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用并具有廣闊的前景。納米技術(shù)用于醫(yī)藥領(lǐng)域克服了傳統(tǒng)藥物許多缺陷,并顯示出許多優(yōu)越性:提高藥物溶解度,延長藥物作用時(shí)間,增加細(xì)胞膜及多種屏障對于藥物的通透性。
　　 目的:
　　 本研究基于海藻糖低溫保護(hù)生物細(xì)胞和活性物質(zhì)的作用,初步探索以海藻糖為基礎(chǔ)的安全有效的PBSC凍存保護(hù)劑的可行性,探討幾種因素對凍存復(fù)蘇后PBSC的存活率、活力及增殖能力的影響,如:海藻糖濃度、負(fù)載溫度、負(fù)

5、載時(shí)間、海藻糖的物理性狀等,篩選出海藻糖導(dǎo)入PBSC的最適濃度、溫度和時(shí)間。比較患者自身和健康供者的PBSC在相同條件下凍存效果的差異。主要目的是探索新型的凍存保護(hù)劑配方,預(yù)防含有DMSO的凍存保護(hù)劑保存的PBSC凍存復(fù)蘇后輸入人體產(chǎn)生的不良反應(yīng),避免DMSO對PBSC的潛在毒性。
　　 方法:
　　 1.用不同濃度海藻糖負(fù)載PBSC,通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測復(fù)蘇后細(xì)胞存活率、顯微鏡下觀察負(fù)載后細(xì)胞形態(tài)的改變、流式細(xì)胞術(shù)測定

6、CD34+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)及甲基纖維素培養(yǎng)體系觀察細(xì)胞增殖能力等,評價(jià)海藻糖負(fù)載PBSC的可行性。
　　 2.在不同負(fù)載溫度(4℃,22℃,37℃)下用海藻糖負(fù)載PBSC不同時(shí)間(1h,2h,3h),通過測定復(fù)蘇后細(xì)胞存活率、CD34+細(xì)胞回收率和細(xì)胞增殖能力等,篩選出海藻糖負(fù)載PBSC的最佳條件。
　　 3.改進(jìn)海藻糖的物理性狀,將海藻糖納米化處理,通過檢測復(fù)蘇后細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖能力等指標(biāo),評價(jià)判斷納米化海藻糖是否有助

7、于提高海藻糖對PBSC低溫保護(hù)作用。
　　 4.比較海藻糖負(fù)載患者自身和健康供者PBSC凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率及細(xì)胞增殖能力的差別。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以(x)±s表示,各組間的差異應(yīng)用One-way ANOVA檢驗(yàn)方法進(jìn)行比較,方差齊性時(shí),組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí),采用Dunnett T3檢驗(yàn)；P<0.05時(shí)表示差異有顯著意義。
　　 結(jié)果:
　　

8、 1.海藻糖深低溫保存PBSC的可行性
　　 凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率:海藻糖濃度為0.5mol/L、1.0mol/L負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率分別為(45.93±7.25)％和(33.20±7.78)％,未添加海藻糖的PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率為(4.00±2.29)％,三者之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001,P=0.000<0.001)。CFU-GM回收率:未添加海藻糖的PB

9、SC凍存復(fù)蘇后由于細(xì)胞存活率過低,無法進(jìn)行集落培養(yǎng),CFU-GM回收率計(jì)為0,海藻糖濃度為0.5mol/L、1.0mol/L負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后CFU-GM回收率分別為(84.66±4.65)％和(73.56±9.56)％,海藻糖濃度為0.5mol/L、1.0mol/L負(fù)載PBSC分別與未添加海藻糖的PBSC凍存復(fù)蘇后CFU-GM回收率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,有顯著差異(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001)。以0.5mol

10、/L濃度的海藻糖與以1.0mol/L濃度的海藻糖負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后,CFU-GM回收率統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示:前者明顯高于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。CD34+細(xì)胞回收率:0.5mol/L、1.0mol/L濃度海藻糖負(fù)載PBSC分別與未添加海藻糖的PBSC凍存復(fù)蘇后比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均=0.000<0.001)。濃度為0.5mol/L與1.0mol/L海藻糖負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.081)。

11、由此可見海藻糖深低溫保存PBSC可行,0.5 mol/L是最佳的海藻糖負(fù)載濃度。
　　 2.海藻糖深低溫保存PBSC的最佳負(fù)載條件研究
　　 用濃度為0.5 mol/L的海藻糖溶液負(fù)載PBSC分別在4℃、22℃、37℃負(fù)載3小時(shí)。結(jié)果顯示,細(xì)胞存活率:4℃與22℃條件下孵育的PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率之間存在顯著差異(P=0.049),4℃、22℃條件下孵育的PBSC分別與37℃條件下孵育的PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率

12、進(jìn)行比較,存在顯著差異(P=0.000)；CD34+細(xì)胞回收率:4℃、37℃條件下孵育的PBSC分別與22℃條件下孵育的PBSC凍存復(fù)蘇后CD34+細(xì)胞回收率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,無顯著差異(P>0.05),4℃與37℃條件下孵育的PBSC凍存復(fù)蘇后CD34+細(xì)胞回收率之間有顯著差異(P<0.05),后者顯著高于前者；CFU-GM回收率:4℃、37℃條件下孵育的PBSC分別與22℃條件下孵育的PBSC凍存復(fù)蘇后CFU-GM回收率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

13、,無顯著差異(P>0.05),4℃與37℃條件下孵育的PBSC凍存復(fù)蘇后CFU-GM回收率之間比較,前者低于后者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此37℃是海藻糖負(fù)載PBSC的最佳負(fù)載溫度。
　　 最佳負(fù)載時(shí)間的研究中,用濃度為0.5 mol/L的海藻糖溶液負(fù)載PBSC在37℃條件下負(fù)載1、2、3h。三個(gè)負(fù)載時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率和CD34+細(xì)胞回收率均無顯著差異(P>0.05):負(fù)載1h與2h、1h與3h的PBSC凍存復(fù)蘇后C

14、FU-GM回收率之間均有顯著差異(P<0.05),負(fù)載1h的PBSC凍存復(fù)蘇后CFU-GM回收率為(90.13±2.60)％,顯著高于負(fù)載2h和3h。負(fù)載2h與3h的PBSC凍存復(fù)蘇后CFU-GM回收率之間無顯著差異(P>0.05)。因此,綜合考慮各因素,1小時(shí)是海藻糖負(fù)載PBSC的最佳負(fù)載時(shí)間。
　　 3.納米化海藻糖深低溫保存PBSC的效果
　　 多重比較結(jié)果顯示:0.5mol/L納米化海藻糖、1.0mol/L納米化

15、海藻與0.5mol/L普通海藻糖負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,差異有顯著意義(P<0.05),0.5mol/L納米化海藻糖與1.0mol/L納米化海藻負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率之間無顯著差異(P>0.05)；0.5mol/L普通海藻糖與0.5mol/L納米化海藻糖、1.0mol/L納米化海藻負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后CFU-GM回收率之間均無顯著差異(P>0.05)。故納米化海藻糖有助于提高海藻糖對PBSC的低溫保護(hù)

16、作用,但是對于PBSC的增殖能力沒有提高。
　　 4.海藻糖深低溫保存患者與健康供者PBSC的效果
　　 來源患者的PBSC與健康供者的PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率、CFU-GM回收率及CD34+細(xì)胞回收率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.001,P=0.009,P=0.030),健康供者的PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率、CFU-GM回收率及CD34+細(xì)胞回收率顯著高于患者的PBSC。
　　 結(jié)論:

17、r>　　 海藻糖對于深低溫保存PBSC有一定的保護(hù)作用,用海藻糖作為PBSC的低溫保護(hù)劑是可行的。海藻糖負(fù)載PBSC的最適宜濃度為0.5mol/L；37℃,1小時(shí)是海藻糖負(fù)載PBSC的最佳條件。海藻糖負(fù)載PBSC凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率可達(dá)58％,復(fù)蘇后的PBSC形態(tài)和集落生長方式都與凍前的生長形態(tài)相同。雖然海藻糖具有對人體無毒副作用的優(yōu)勢,但是與DMSO相比,海藻糖的保護(hù)效果仍較低,尚未達(dá)到臨床應(yīng)用的理想效果。海藻糖為非滲透性保護(hù)劑,研