口服食物抗原誘導(dǎo)的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià).pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以慢性、進(jìn)行性、侵襲性關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫疾病。如果不經(jīng)過(guò)正規(guī)治療,患者病情會(huì)逐漸發(fā)展,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形、功能喪失。RA具有很高的致殘率,嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量,同時(shí)也給患者家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 眾多研究已表明食物與RA的發(fā)生密切相關(guān)。目前通過(guò)皮下注射Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA模型是最佳的RA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。盡管通過(guò)注射的方式能成功有

2、效地誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,但皮下注射的誘導(dǎo)方式并不符合人體攝食模式,其忽略了胃腸道在RA發(fā)病中的重要性,使RA發(fā)病機(jī)制的研究出現(xiàn)了一個(gè)極為重要的空白點(diǎn):即食物抗原在人體攝食過(guò)程中如何通過(guò)腸上皮粘膜屏障進(jìn)入腸道粘膜固有層,引起腸道相關(guān)免疫組織細(xì)胞的一系列免疫應(yīng)答,擾亂腸粘膜免疫組織的固有與適應(yīng)性免疫反應(yīng),并通過(guò)分子擬態(tài)和旁觀者效應(yīng)打破免疫耐受,進(jìn)而導(dǎo)致RA發(fā)生的機(jī)理。為了深入RA發(fā)病機(jī)制的研究,建立一種與人RA發(fā)病機(jī)制及病理相同或相似

3、的動(dòng)物模型(口服食物抗原誘導(dǎo)的RA動(dòng)物模型)在RA研究中的作用也就顯得尤為重要。
　　 目的:
　　 建立口服牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)的RA大鼠模型；確定口服食物抗原與RA的相關(guān)性；并在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,對(duì)腸道通透性在食物抗原誘導(dǎo)的RA發(fā)病機(jī)理中的作用進(jìn)行初步探索,為臨床RA的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究選擇Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。從牛軟骨中提取牛Ⅱ型膠原蛋白,先用阿司匹林破壞大鼠

4、的腸道粘膜屏障功能,然后灌胃給予大鼠較大劑量的牛Ⅱ型膠原蛋白,誘導(dǎo)大鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。將4～5周齡雌性Wistar大鼠隨機(jī)分成四組:對(duì)照組(生理鹽水；生理鹽水)、M1組(生理鹽水；生理鹽水+CCl4+LPS)、M2組(5mg／kg阿司匹林；牛Ⅱ型膠原蛋白+CCl4+LPS)、M3組(10mg／kg阿司匹林；牛Ⅱ型膠原蛋白+CCl4+LPS)。在阿司匹林灌胃期間,每七天灌胃給予大鼠一定量的乳果糖和甘露醇,用代謝籠收集大鼠24h尿,高效

5、液相色譜儀(HPLC)檢測(cè)并計(jì)算乳果糖、甘露醇比值(L／M),并將M2組、M3組與對(duì)照組相比,間接評(píng)價(jià)大鼠腸道通透性的變化情況。建模過(guò)程中,用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄大鼠右后腿踝關(guān)節(jié)的直徑,兩周一次,一共5次,并進(jìn)行關(guān)節(jié)指數(shù)(AI)評(píng)定。建模結(jié)束后,取大鼠血清、空腸組織和踝關(guān)節(jié)組織。采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定各組大鼠血清中牛Ⅱ型膠原蛋白特異性抗體水平、細(xì)胞因子TNF-a、IFN-r和IL-4水平；將所取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空腸和踝關(guān)節(jié)組織用固定液固

6、定后,石蠟包埋切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察其病理形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)滲透的情況；用熒光免疫組織化學(xué)的方法,以小鼠來(lái)源的牛Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體作為一抗,以FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG作為二抗,定位空腸中的牛Ⅱ型膠原蛋白,觀察其是否能夠通過(guò)腸粘膜的屏障從而進(jìn)入腸道粘膜固有層；用熒光免疫組織化學(xué)的方法,以小鼠來(lái)源的牛Ⅱ型膠原蛋白單克隆抗體作為一抗,以FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG作為二抗,定位關(guān)節(jié)滑膜上的

7、牛Ⅱ型膠原蛋白,觀察其在關(guān)節(jié)滑膜上的沉積情況。通過(guò)以上指標(biāo)對(duì)所建立的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果:
　　 在建模結(jié)束后,M2組、M3組大鼠踝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)不同程度的腫脹；M2組、M3組大鼠血清中抗牛Ⅱ型膠原蛋白特異性抗體顯著升高(P<0.05),血清中TNF-a和IFN-r水平明顯升高(P<0.05),并且IL-4水平明顯降低(P<0.05)；M2組、M3組大鼠空腸病理學(xué)改變明顯:腸粘膜損傷嚴(yán)重,粘膜下層中性

8、粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,腸絨毛水腫肥大,腸粘膜上皮細(xì)胞廣泛脫落等；熒光免疫組化顯示未經(jīng)消化的大分子牛Ⅱ型膠原蛋白透過(guò)損傷的腸上皮粘膜屏障進(jìn)入腸道粘膜固有層；在M2組、M3組大鼠踝關(guān)節(jié)標(biāo)本組織學(xué)中觀察到滑膜組織增生,其局部骨吸收破壞明顯,軟骨表層膠原纖維松解斷裂、軟骨細(xì)胞變性壞死,軟骨表面凸凹不平等；并通過(guò)熒光免疫組化的方法觀察到M2組、M3組大鼠關(guān)節(jié)滑膜上牛Ⅱ型膠原蛋白的沉積。雙糖實(shí)驗(yàn),M2組、M3組大鼠尿中的甘露醇濃度降低(P<0.05),乳