用酵母雙雜交技術篩選PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白.pdf

1、催化DNA雙鏈解開的酶是解螺旋酶，在幾乎所有的核酸代謝過程（包括DNA復制、轉錄、重組、修復）中都有重要作用。DNA解螺旋酶的一級結構中存在一些高度保守的氨基酸序列，被稱作解螺旋酶模序（helicasemotif）。
　　PIF1解螺旋酶家族是5'至3'解螺旋酶，在從酵母到人的進化中非常保守。在酵母中Pif1解螺旋酶的作用包括DNA修復、端粒長度的調節(jié)、DNA復制及遺傳穩(wěn)定性維持。人PIF1解螺旋酶功能所知甚少，在我們的前期研究中

2、，通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)PIF1家族蛋白在其解螺旋酶模序的上游—PIF1蛋白的N-末端在進化中也很保守，我們將其命名為PINT功能域(PIF1N-terminal，domain),我們研究還發(fā)現(xiàn)PINT功能域，具有使單鏈DNA退火形成雙鏈的能力，且對整個解螺旋酶活性的調節(jié)具有重要作用。
　　本課題擬在已有工作的基礎上，利用酵母雙雜交（yeasttwo-hybridssystem）技術，尋找與PIF1相互作用的靶蛋白或上游信號分子

3、，以期進一步明確人PIF1解螺旋酶在體內可能的生理功能。
　　我們分別用PIF1的PINT功能域（PIF1N）和PIF1的解螺旋酶模序（PIF1C）作為誘餌，用酵母雙雜交系統(tǒng)分別篩選人HeLa文庫，以尋找與各個功能域相互作用的蛋白。誘餌片段由聚合酶鏈式反應（PCR）擴增后連入酵母表達質粒pGB，測序檢測pGB-Bait質粒，正確后轉入酵母菌Y190。再用β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）顯色實驗檢測誘餌蛋白是否有自激

4、活，確定無自激活后將人Hela文庫轉入能夠穩(wěn)定表達誘餌蛋白的酵母菌株中，用缺陷平板（SD/-Leu-Trp-His+3AT）高強度篩選，將得到的陽性菌落擴增抽質粒。然后，將抽提的質粒與pGB-Bait共轉化到Y190，進一步確認初篩為陽性的克隆。最后用生物信息學來分析篩選呈陽性克隆的文庫質粒。
　　最終，以pGB-PIF1N為誘餌蛋白篩選人Hela文庫，我們得到15個陽性克隆，對陽性克隆測序并對結果進行分析得到3條陽性基因：CCN