外周血CD4+T細胞DNA甲基化異常的研究.pdf

1、第一部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細胞DNA總體甲基化異常的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細胞DNA總體甲基化狀態(tài)，從而探討自身免疫糖尿病患者的表觀遺傳學改變。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對照的外周血單個核細胞，磁珠法分選CD4+T細胞，抽提DNA，然后用總體甲基化定量試劑盒檢測兩組自身免疫糖尿病患者和正常對照C

2、D4+T細胞的DNA總體甲基化水平。
　　 結果：與正常對照組相比，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細胞基因組DNA總體甲基化水平增高(P=0.047);成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細胞基因組DNA總體甲基化水平較正常對照組相比也增高(P=0.046)。
　　 結論：自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細胞DNA呈現(xiàn)總體高甲基化水平。
　　 第二部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細胞甲基化相關調(diào)控基因表達

3、的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細胞DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）和甲基結合蛋白(MBD)的表達水平。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對照的外周血單個核細胞，磁珠法分選CD4+T細胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量聚合酶鏈反應檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)和甲基結合蛋白(MBD)的mRNA表達。
　　 結果

4、：與正常對照相比，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細胞DNMT3b的mRNA水平明顯增高(P=0.038)，MBD0mRNA表達水平明顯降低（P=0.042）;成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細胞DNMT3b的mRNA水平也明顯增高(P=0.040)，MBD的mRNA水平無明顯差異。同時，經(jīng)典1型糖尿病患者CD4+T細胞DNA總體甲基化水平與DNMT3b mRNA表達水平呈正相關（r=0.567，P=0.009）。成人隱匿性自身免疫糖

5、尿病患者的DNA總體甲基化水平也與DNMT3b mRNA表達水平呈正相關（r=0.422，P=0.032）。
　　 結論：自身免疫糖尿病患者CD4+T細胞DNA甲基化相關調(diào)控基因表達異常，與自身免疫糖尿病患者CD4+T細胞DNA總體甲基化異常狀態(tài)相關。
　　 第三部分自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細胞自身免疫反應相關基因表達及其調(diào)節(jié)序列甲基化狀態(tài)的研究
　　 目的：研究自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細胞自

6、身免疫反應相關基因表達及其調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)。
　　 方法：密度梯度離心法分離20例經(jīng)典1型糖尿病患者、15例成人隱匿性自身免疫糖尿病患者和19例正常對照的外周血單個核細胞，磁珠法分選CD4+T細胞，抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量聚合酶鏈反應檢測Foxp3、ICOS、CTLA-4、IFNG、IL10、 IL2、IL17和IL4的mRNA表達水平;流式細胞檢測外周血單個核細胞中CD11a及CD40L在CD4+T細胞中的

7、表達水平;western-blot檢測Foxp3蛋白表達水平;亞硫酸氫鈉測序檢測Foxp3基因調(diào)節(jié)序列的甲基化狀態(tài)。
　　 結果：與正常對照組相比，經(jīng)典1型糖尿病患者外周血CD4+T細胞Foxp3表達下降，且其基因調(diào)節(jié)序列呈明顯的高甲基化(P=0.046);成人隱匿性自身免疫糖尿病患者CD4+T細胞Foxp3表達也降低，其基因調(diào)節(jié)序列亦呈明顯的高甲基化(P=0.047)。
　　 結論：自身免疫糖尿病患者外周血CD4+T細