異常DNA甲基化在MPP+誘導(dǎo)帕金森病細(xì)胞模型中的研究.pdf

1、背景:帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的年齡相關(guān)、呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。近年來越來越多研究顯示表觀遺傳修飾異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，神經(jīng)退行性疾病中也已有許多報(bào)道DNA甲基化等表觀遺傳改變參與甚至決定發(fā)病進(jìn)程。明確帕金森病病因及其發(fā)病機(jī)制，尋找切實(shí)有效的治療手段，成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。
　　目的:通過神經(jīng)毒素MPP+誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷SH-SY5Y構(gòu)建PD細(xì)

2、胞模型，1）探究DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)和甲基化CpG結(jié)合蛋白（如MBD2）的表達(dá)情況以及可能的調(diào)控機(jī)制;2）檢測PD致病相關(guān)基因的甲基化水平和mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。探討DNA甲基化在帕金森病發(fā)病機(jī)制中所起的作用。
　　方法:
　　1.MPP+誘導(dǎo)的SH-SYSY細(xì)胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MBD2的表達(dá)變化。
　　1.1 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，設(shè)正常對照組

3、和0.1mmol/L、0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L4個(gè)MPP+濃度組，藥物處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h，用Western Blotting方法檢測MPP+誘導(dǎo)損傷后的SH-SY5Y細(xì)胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MBD2的表達(dá)變化。
　　1.2 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，選用1mmol/L MPP+，處理后分別培養(yǎng)0，6，12，24h，用Western Blotting方法檢測DNMT1、D

4、NMT3A、DNMT3B和MBD2的表達(dá)變化。
　　2.MPP+、抗氧化劑NAC以及兩者聯(lián)合處理SH-SY5Y細(xì)胞后ROS水平的變化以及DNMT1和DNMT3A水平的變化。
　　取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，設(shè)陰性對照組（空白組）、MPP+(1mmol/L)組、NAC組和NAC+MPP+(1mmol/L)組共4組，處理24h后，(1)用ROS敏感性熒光探針(DCF)測定ROS水平對活力;(2)用Western Blott

5、ing方法檢測DNMT1和DNMT3A的表達(dá)變化。
　　3.MPP+、抗氧化劑NAC以及兩者聯(lián)合處理SH-SY5Y細(xì)胞后SNCA的甲基化水平和轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。
　　取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，設(shè)陰性對照組（空白組）、MPP+(1mmol/L)組、NAC組和NAC+MPP+(1mmol/L)組共4組，處理36h后，(1)用亞硫酸氫鹽測序PCR(BSP)測定SNCA的甲基化水平;(2)用RT-qPCR方法檢測方法檢SNCA的

6、mRNA水平。
　　結(jié)果:
　　1.MPP+導(dǎo)致DNMT1和DNMT3A的下降呈時(shí)間、劑量依賴性。
　　用MPP+濃度分別為0.1，0.25，0.5和1.0mmol/L處理SH-SY5Y24小時(shí)可以導(dǎo)致DNMT1和DNMT3A呈現(xiàn)劑量依賴的下降，而DNMT3B和MBD2則沒有明顯的變化;當(dāng)選用1.0mmol/L MPP+處理SH-SY5Y分別為0，6，12，24小時(shí)，DNMT1和DNMT3A的下降呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。

7、r>　　2.NAC預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)MPP+處理SH-SY5Y導(dǎo)致的DNMT1和DNMT3A的下降。
　　選用1.0mmol/L MPP+處理SH-SY5Y24小時(shí)可以導(dǎo)致ROS水平明顯升高，而用4mmol/L NAC預(yù)處理SH-SY5Y1小時(shí)，可以使ROS水平基本恢復(fù)至正常水平;而相應(yīng)的，NAC預(yù)處理使DNMT1完全回復(fù)至原有水平，DNMT3A部分回復(fù)至原有水平。
　　3.MPP+可以導(dǎo)致SNCA1號內(nèi)含子區(qū)的CpG島去甲基化

8、，而NAC預(yù)處理則可使甲基化水平恢復(fù)至原有水平。
　　CpG島預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)SNCA基因有兩個(gè)CpG島:分別位于啟動子區(qū)(CpG-1)和1號內(nèi)含子區(qū)（CpG-2）。亞硫酸氫鹽測序PCR發(fā)現(xiàn):MPP+處理SH-SY5Y24小時(shí)使CpG-2的23個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平明顯下降:13.0±4.3％(MPP+組)VS30.4±7.2％（對照組），而CpG-1的甲基化水平?jīng)]有明顯改變。NAC預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)的甲基化水平下降:25

9、.7±11.6％(MPP+組)VS13.0±4.3％(NAC+MPP+組)。進(jìn)一步分析CpG-2的單個(gè)CpG位點(diǎn)發(fā)現(xiàn):除外第1、2、3、5、8、13和15 CpG位點(diǎn)，其他所有CpG位點(diǎn)在MPP+處理均發(fā)生了去甲基化;另外，除外第4、20和23CpG位點(diǎn)，NAC預(yù)處理使所有發(fā)生去甲基化的位點(diǎn)都有不同程度地恢復(fù)至原始水平。
　　4.SNCA1號內(nèi)含子區(qū)的CpG島甲基化狀態(tài)直接調(diào)控α-核突觸蛋白的表達(dá)。
　　MPP+處理使SNC

10、A mRNA水平顯著升高，而NAC預(yù)處理顯著逆轉(zhuǎn)MPP+的作用。SNCA mRNA水平與SNCA1號內(nèi)含子區(qū)的CpG島甲基化狀態(tài)基本一致。
　　結(jié)論:
　　1.在MPP+誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷SH-SY5Y構(gòu)建的PD細(xì)胞模型中，DNA甲基化酶（DNMT1和DNMT3A）表達(dá)降低。提示異常DNA甲基化與PD相關(guān)。
　　2.ROS水平能夠調(diào)控DNMT1和DNMT3A的表達(dá)。表明在PD中，氧化應(yīng)激可能作為DNA甲基化酶異常的上游通