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文檔簡介
1、目的:
探討PARP抑制劑HD-199、HD-199-M單獨(dú)使用及分別與DDP聯(lián)合應(yīng)用對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231體外增殖的抑制作用,及二者分別與DDP聯(lián)合是否有協(xié)同作用。為該P(yáng)ARP抑制劑的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),期望可為臨床改善乳腺癌的預(yù)后提供新的有效的藥物。
方法:
體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,倒置光學(xué)顯微鏡下觀察藥物作用前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變,用四甲基偶氮唑鹽(tetrazo
2、lium-based colorimetrie assay,MTT)比色法分別測定HD-199(5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml)、HD-199-M(5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml)及DDP(5μg/ml)單獨(dú)用藥對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24h、48h及72h的抑制作用,同時(shí)測定HD-199、HD-199-M在5μg/ml、45μg/ml兩個(gè)濃度下分別與DDP(2.5μg/ml)聯(lián)合應(yīng)用對人乳腺癌MD
3、A-MB-231細(xì)胞24h、48h及72h的抑制效果,并用q值評價(jià)其聯(lián)合效應(yīng);Hoechst33342/PI雙染法測定HD-199(15μg/ml)、HD-199-M(15μg/ml)單獨(dú)或與DDP(2.5μg/ml)聯(lián)合應(yīng)用對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡的影響;AnnexinV-FITC/PI雙染法在流式細(xì)胞儀上檢測HD-199(15μg/ml)、HD-199-M(15μg/ml)單獨(dú)或與DDP(2.5μg/ml)聯(lián)合作用2
4、4h、48h及72h后人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的凋亡率。
結(jié)果:
1.倒置顯微鏡的觀察結(jié)果可見,加藥組細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞皺縮,有細(xì)胞碎片及顆粒物質(zhì)形成,在顯微鏡下可看到凋亡或者或者壞死細(xì)胞的折光率變?nèi)?細(xì)胞邊緣不清晰。隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長,細(xì)胞數(shù)目逐步減少,可見較多的壞死和凋亡細(xì)胞。
2.HD-199在5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml三個(gè)
5、濃度下可抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖,24h的抑制率依次為4.54±1.20%、8.18±1.11%、10.7±1.05%;48h的抑制率依次為9.31±2.08%、10.9±1.31%、12.6±2.11%;72h的抑制率依次為6.45±2.24%、10.9±1.92%、13.4±2.12%。HD-199-M在5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml三個(gè)濃度下亦能抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖,其24h的
6、抑制率依次為10.0±2.06%、20.3±1.24%、37.1±2.19%;48h的抑制率依次為23.2±2.19%、29.9±3.08%、41.4±2.26%;72h的抑制率依次為21.2±2.16%、34.3±2.27%、55.0±1.55%。由以上數(shù)據(jù)可知,該P(yáng)ARP抑制劑對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制呈劑量和時(shí)間的依賴性(P<0.01)。
3.DDP在5μg/ml對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞有很好的抑制作用,其2
7、4h、48h、72h的OD值依次為0.287±0.012、0.379±0.010、0.434±0.011,與空白對照組24h、48h、72h的OD值0.443±0.005、0.765±0.006、1.208±0.007相比,OD值減小;抑制率依次為35.2±2.37%、50.4±1.63%、64.0±2.13%,比HD-199單藥組和HD-199-M單藥組的抑制效果好。
4.15μg/mlHD-199+2.5μg/mlDD
8、P聯(lián)合用藥組24h、48h、72h的q值依次為1.36、1.32、1.25;45μg/mlHD-199+2.5μg/mlDDP聯(lián)合用藥組24h、48h、72h的q值依次為1.39、1.36、1.27;其q值均大于1.1.5,表示兩藥聯(lián)合使用具有增效作用;15μg/mlHD-199+2.5μg/mlDDP聯(lián)合用藥組24h、48h、72h的q值依次為0.65、1.27、1.14,24h的q值小于0.85,表示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有拮抗作用,48h
9、的q值大于1.15,表示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有增效作用,72h的q值在0.85~1.15范圍內(nèi),表示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有相加作用;45μg/mlHD-199+2.5μg/mlDDP聯(lián)合用藥組24h、48h、72h的q值依次為0.95、1.26、1.15,24h的q值在0.85~1.15范圍內(nèi),表示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有加和作用;48h、72h的q值大于1.15,表示兩藥聯(lián)合應(yīng)用具有增效作用。HD-199與DDP聯(lián)合應(yīng)用對MDA-MB-231細(xì)胞抑制效果
10、的增加要比HD-199-M與DDP聯(lián)合應(yīng)用對MDA-MB-231細(xì)胞抑制效果的增加要明顯。
5.Hoechst33342/PI雙染法在熒光顯微鏡下可見空白對照組細(xì)胞核的Hoechst著色形態(tài)呈圓形、淡藍(lán)色、核內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒、染色質(zhì)分布均勻;用藥組細(xì)胞部分呈現(xiàn)細(xì)胞體積縮小,核仁減少或者消失,胞漿濃縮,染色質(zhì)濃縮。
6.Annexin V-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果表明,15μg/mlHD-199單藥組24
11、h、48h、72h的凋亡率分別為8.6±0.99%、10.5±0.92%、13.8±1.65%,晚期凋亡細(xì)胞在總的凋亡細(xì)胞占的比例依次為52.3%、55.2%、52.9%;15μg/mlHD-199-M單藥組24h、48h、72h的凋亡率分別為10.2±1.91%、12.7±1.37%、15.0±1.54%,晚期凋亡細(xì)胞在總的凋亡細(xì)胞占的比例依次為51.0%、49.6%、50.7%;15μg/mlHD-199-M+2.5μg/mlDDP
12、組24h、48h、72h的凋亡率分別為16.3±1.12%、17.8±1.29%、19.8±0.89%,晚期凋亡細(xì)胞在總的凋亡細(xì)胞占的比例依次為53.4%、57.9%、63.1%;45μg/mlHD-199-M+2.5μg/mlDDP組24h、48h、72h的凋亡率分別為17.3±1.79%、20.1±1.33%、23.2±1.42%,晚期凋亡細(xì)胞在總的凋亡細(xì)胞占的比例依次為54.3%、57.7%、57.8%,可知經(jīng)藥物作用后晚期凋亡細(xì)
13、胞在總的凋亡細(xì)胞中占較大的比例。
結(jié)論:
1.HD-199、HD-199-M在一定范圍內(nèi)能抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間的依賴性。
2.DDP對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞有很好的抑制作用,比HD-199單藥組及HD-199-M單藥組的抑制都要強(qiáng)。
3.低毒劑量的HD-199、HD-199-M與DDP聯(lián)合使用能增強(qiáng)對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制,兩
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