人PD-L1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制.pdf

1、PD-L1屬于共刺激分子B7家族成員，含有290個(gè)氨基酸，是I型跨膜蛋白。PD-L1廣泛表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及一些非造血細(xì)胞。PD-L1與其受體PD-1結(jié)合后傳遞抑制信號(hào)，在T細(xì)胞的活化、耐受和免疫介導(dǎo)的組織損傷中發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，參與機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持。PD-1/PD-L1途徑與自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)、慢性病毒感染及腫瘤免疫等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。PD-L1分子在多種腫瘤組織中表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的分化

2、程度、TNM分期及不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為多種腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物及診斷和治療的靶點(diǎn)。
　　本文構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/PD-L1，觀察了PD-1/PD-L1途徑對(duì)活化Jurkat細(xì)胞增殖與凋亡的影響，證實(shí)PD-L1的負(fù)性免疫調(diào)控作用；以L929/PD-L1為免疫原，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，建立了穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并初步研究單抗的生物學(xué)特性。
　　一、人

3、PD-L1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建及其對(duì)活化Jurkat細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　【目的】構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，并鑒定其生物學(xué)活性。
　　【方法】將編碼人PD-L1分子的全長(zhǎng) cDNA重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pEGZ-Term-R，采用脂質(zhì)體法將重組載體pEGZ-Term-R/PD-L1和輔助的病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝具有感染能力的完整病毒，收集含有完整重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清，感染L929細(xì)

4、胞，篩選并獲得G418抗性的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)篩選并獲得表達(dá)PD-L1的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，命名為L(zhǎng)929/PD-L1。采用PHA活化T細(xì)胞系來(lái)源的細(xì)胞株 Jurkat，并將其與絲裂霉素預(yù)處理的L929/PD-L1細(xì)胞共培養(yǎng)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察L929/PD-L1細(xì)胞株對(duì)活化Jurkat細(xì)胞增殖能力的影響，并檢測(cè)其凋亡情況。
　　【結(jié)果】成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929/PD-L1。PHA可誘導(dǎo)Jurkat

5、細(xì)胞活化并表達(dá)PD-1分子；L929/PD-L1與PHA刺激后Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)，可抑制Jurkat細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。
　　【結(jié)論】成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人PD-L1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，PD-L1分子對(duì)活化Jurkat細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的促進(jìn)，進(jìn)一步證實(shí)了PD-1/PD-L1途徑的負(fù)性免疫調(diào)控作用，也為進(jìn)一步探討PD-L1的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。
　　二、鼠抗人PD-L1單克隆抗體的研制
　　【目的】研制鼠抗人

6、PD-L1單克隆抗體，為探討PD-1/PD-L1途徑在免疫病理機(jī)制中的作用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　【方法】以L929/PD-L1為免疫原免疫6-8周齡的BALB/c雌鼠，將骨髓瘤細(xì)胞P3X63Ag8與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞融合，采用HAT和HT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤。以L929/PD-L1細(xì)胞株為陽(yáng)性篩選抗原，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定、有限稀釋法亞克隆、western blot鑒定等篩選分泌特異性鼠抗人PD-L1單抗的雜交瘤細(xì)胞株；利用小鼠免疫

7、球蛋白亞類快速定性試紙鑒定單抗亞型；以L929/PD-L1細(xì)胞為抗原，采用競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析單抗的識(shí)別位點(diǎn)；進(jìn)而比較所獲單抗與商品化單抗MIH1對(duì)腫瘤細(xì)胞株表達(dá)的PD-L1分子的識(shí)別。
　　【結(jié)果】成功獲得l株能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為6G4；經(jīng)小鼠免疫球蛋白亞類快速定性試紙分析鑒定，6G4的重鏈為IgM，輕鏈為κ鏈；競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)顯示，單抗6G4與商品化抗人PD-L1單抗MIH1識(shí)別的