人LIGHT基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建及鼠抗人LIGHT單克隆抗體的研制.pdf

1、人LIGHT(TNFSFl4)屬于TNF超家族成員，為Ⅱ型跨膜糖蛋白，編碼240個(gè)氨基酸。原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)人LIGHT定位于19p13．3，與CD27L，4．1BBL，c3相鄰。LIGHT與LTβ和FasL分別有34％和31％的同源性，而且LIGHT與LTαβ異源三聚體結(jié)合同一個(gè)受體LTBR，與LTα結(jié)合同一個(gè)受體HVEM，與FasL結(jié)合同一個(gè)受體DeR3。LIGHT主要表達(dá)在活化T細(xì)胞和未成熟DC，其mRNA在脾臟細(xì)胞、活化的PBL、

2、CD8+腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均有高表達(dá)，但不表達(dá)于胸腺組織。一些研究結(jié)果表明，LIGHT可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，也可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞細(xì)胞活化，這都依賴于靶細(xì)胞表達(dá)的受體。研究顯示，LIGHT是不依賴于CD28的可誘導(dǎo)型表達(dá)的共刺激分子，可有效地協(xié)同CD3信號(hào)促進(jìn)T細(xì)胞的增殖，同時(shí)它也可以促進(jìn)DC成熟，提高DC對(duì)抗原的提呈能力；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可溶性LIGHT分子可使一些惡性腫瘤生長減緩甚至可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，可溶性和膜型LI

3、GHT與其受體形成的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在免疫應(yīng)答和抗腫瘤免疫中有重要的作用。 1人LIGHT基因的克隆 采用RT-PCR的方法，從活化T細(xì)胞中克隆得到了人LIGHTcDNA，將其裝入克隆載體pMDl8-T，得重組載體pMDl8-T／LIGHT，酶切、PCR和測(cè)序鑒定正確。由此，為人LIGHT基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 2人LIGHT基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的構(gòu)建 通過基因克隆技術(shù)，將人LIGHT全長的cDNA片段插入逆

4、轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-HA-Term。測(cè)序正確后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達(dá)載體(pEGZ-HA．Term／LIGHT)與輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，用其培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞72h后，經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達(dá)LIGHT分子的L929細(xì)胞株(L929／LIGHT)。經(jīng)體外長期傳代和液氮反復(fù)凍存復(fù)蘇，基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長良好，LIGHT的表達(dá)穩(wěn)定在95％以上。 3L929／LIGHT基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的共刺激作用

5、 將人外周血T細(xì)胞加入包被有抗人CD3激發(fā)型單抗的24孔或96孔板中，絲裂霉素處理的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929／LIGHT為刺激細(xì)胞，L929／mock為對(duì)照細(xì)胞，共培養(yǎng)3天。MTT法的分析結(jié)果顯示，人CD3激發(fā)型單抗聯(lián)合L929／LIGHT組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比能顯著地促進(jìn)T細(xì)胞增殖。ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的分泌，結(jié)果顯示基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929／LIGHT能顯著促進(jìn)人外周血T細(xì)胞分泌IFN-γ。 4分泌鼠抗人LIGHT單抗的

6、雜交瘤細(xì)胞株的制備 用已建立的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為免疫原，免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓細(xì)胞SP2／0進(jìn)行細(xì)胞融合，以上述基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陽性篩選細(xì)胞，以轉(zhuǎn)質(zhì)粒的對(duì)照細(xì)胞L929／mock作為陰性對(duì)照細(xì)胞，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記分析及抗體分泌陽性孔內(nèi)雜交瘤細(xì)胞的反復(fù)篩選，并經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，最終獲得4株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人LIGHT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2G4、2A11、1F12、1D1

7、l。經(jīng)快速定性試紙法分析鑒定，2G4重鏈為IgG2a；其它均為IgGl；輕鏈均為K。經(jīng)體外連續(xù)培養(yǎng)半年以上，液氮凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞的生長狀態(tài)良好，分泌抗體的性能穩(wěn)定。 繼而采用本室建立的腹水誘生和純化方案，腹水形成陽性率為95％以上，腹水的產(chǎn)量平均為5．0ml／只小鼠。經(jīng)ProteinG親和層析柱分離純化，腹水型單抗純化后蛋白含量在0．8～10mg／ml之間。純化后單抗的效價(jià)為1：1000以上，抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為

8、0．2～2μg/1×10°細(xì)胞。 5鼠抗人LIGHT單克隆抗體對(duì)LIGHT膜分子的識(shí)別 westemblot方法檢測(cè)四株單抗與L929／LIGHT細(xì)胞膜上的LIGHT分子結(jié)合情況，結(jié)果顯示四株單抗均可以在蛋白水平上與LIGHT分子結(jié)合。利用已純化的單抗間接免疫熒光法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞株上LIGHT分子的表達(dá)，結(jié)果表明大部分腫瘤細(xì)胞株不表達(dá)，而乳腺癌、肺癌的一些細(xì)胞株表達(dá)LIGHT分子。 6四株抗LIGHT單克隆抗體識(shí)別

9、不同的抗原位點(diǎn) 為了檢測(cè)四株單抗識(shí)別LIGHT分子的表位，分別用生物素標(biāo)記四株單抗，兩兩比較結(jié)合位點(diǎn)的異同。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)四株單抗識(shí)別抗原位點(diǎn)各不相同。這為研究LIGHT的生物學(xué)特性和制備LIGHTELISA試制盒奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 7T細(xì)胞和DCLIGHT分子表達(dá)的生物學(xué)特性分析 使用己研制的抗人LIGHT單克隆抗體和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LIGHT分子在T細(xì)胞活化和DC分化過程中的表達(dá)顯示，LIGHT在T細(xì)胞活

10、化過程中呈暫時(shí)性表達(dá)，而只有未成熟單核細(xì)胞來源的DC(Mo-DC)高表達(dá)LIGHT分子，隨著Mo-DC的體外誘導(dǎo)成熟而表達(dá)下調(diào)。 8兩株單克隆抗體2G4、2All阻斷LIGHT信號(hào)介導(dǎo)的協(xié)同刺激作用 在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞協(xié)同激發(fā)型CD3mAb刺激T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，加入2G4、2All單抗，結(jié)果顯示這兩株單克隆抗體可部分阻斷T細(xì)胞經(jīng)由基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞協(xié)同CD3mAb刺激的增殖。由此提示2G4、2AllmAb可能為阻斷型單克隆抗體