抑制STAT3信號(hào)通路活化對(duì)LPS誘導(dǎo)的ARDS炎癥反應(yīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的病理基礎(chǔ)是各種肺內(nèi)外原因（包括直接原因和間接原因）導(dǎo)致的肺泡-毛細(xì)血管通透性增加，進(jìn)而引起肺不張及過(guò)度失控的肺部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致急性、進(jìn)行性加重的呼吸衰竭，其病死率可高達(dá)30％-60％。在ARDS的早期階段，單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活，釋放炎癥細(xì)胞因子如白介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、IL-8、腫瘤壞死因子-α(t

2、umor necrosis factor-α，TNF-α)等，在這些炎癥細(xì)胞因子的作用下，中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等被激活，進(jìn)而引起肺組織中大量的炎癥細(xì)胞（包括中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）浸潤(rùn)及激活，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而且可以使炎癥反應(yīng)部位血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)增加，最終導(dǎo)致肺組織損傷。
　　JAK-STAT是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究表明許多細(xì)胞因子(IFN、IL-2、IL-4、IL-6、CNTF等)和生長(zhǎng)因子(

3、EGF、PDGF、CSF等)都利用該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化或凋亡，它們?cè)诿庖吖δ苷{(diào)節(jié)、造血細(xì)胞生成、腫瘤發(fā)生及神經(jīng)和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著既特異又有多效性的生物學(xué)功能。信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)可通過(guò)介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控免疫細(xì)胞的生物學(xué)行為，是炎癥形成過(guò)程中不可或缺的關(guān)鍵性分子。STAT3信號(hào)通路的激活可活化巨

4、噬細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，加重ARDS的疾病進(jìn)程。
　　STAT3的特異性抑制劑LLL12，是STA-21的衍生物?？商禺愋耘cSTAT3中的tyrosine705(Y705)結(jié)合，阻止STAT3信號(hào)通路活化及其下游的反應(yīng)，進(jìn)而可使細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子的表達(dá)減少，抑制中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集。
　　目的：
　　本研究探討在小鼠ARDS過(guò)程中，應(yīng)用STAT3抑制劑LLL12和條件性敲除S

5、TAT3活化的負(fù)調(diào)節(jié)因子(SOCS3)后，觀察STAT3的活化程度，以及肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的變化，以明確STAT3的激活在ARDS中的促炎作用，從而為治療ARDS提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　動(dòng)物模型的建立及分組
　　鼻內(nèi)滴入50 ul LPS(100mg/kg)建立C57BL/6小鼠、SOCS3fl/fl小鼠、LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠ARDS模型，隨機(jī)分對(duì)照組(UN組)、

6、脂多糖組(LPS組)、LLL12干預(yù)組(LPS+LLL12組)。于鼻內(nèi)滴入LPS前2小時(shí)腹腔內(nèi)注射LLL12(5mg/kg)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠ARDS的干預(yù)。UN組腹腔內(nèi)注射20ml/kg的生理鹽水。
　　標(biāo)本的采集:
　　每組小鼠于造模后24h、48h、72h及96h吸入異氟烷(100mg/Kg)麻醉。并采集血液和BALF，留肺組織行HE染色，檢測(cè)血液及BALF中炎癥細(xì)胞以及血清和BALF中細(xì)胞因子表達(dá)的變化。體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，

7、分別給予LPS、LPS和LLL12刺激，檢測(cè)STAT3、STAT1、NF-κB以及ERK1/2的磷酸化程度同時(shí)檢測(cè)TNF-α、IL-1β和iNOS的表達(dá)情況。
　　檢測(cè)方法及指標(biāo):
　　1.HE染色評(píng)估肺組織病理?yè)p傷及評(píng)分，同時(shí)測(cè)定肺泡-動(dòng)脈氧分壓差及肺濕干重比值(W/D)。
　　2.取BALF細(xì)胞沉渣，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)，計(jì)數(shù)單核白細(xì)胞總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+的比例，同時(shí)檢測(cè)STAT3的磷

8、酸化程度。
　　3.收集BALF上清液及備用血清，ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β及CCL2的水平。
　　4.采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　5.采用Western Blot方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路的活化情況。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況:
　　UN組小鼠呼吸平穩(wěn)，解剖后肺部外觀色澤粉紅;LPS組小鼠呼吸急促，

9、口唇發(fā)紺，解剖后肺體積增大，色澤暗紅或紫紅，臟層胸膜下點(diǎn)狀、片狀出血，與SOCS3fl/fl小鼠的一般情況相比，LysMCre-SOCSfl/fl小鼠的呼吸、進(jìn)食、活動(dòng)能力及肺組織的體積和出血情況均明顯加重;LPS+LLL12組小鼠均可見呼吸急促減輕，解剖后肺體積無(wú)明顯增大，色澤呈紅色，表面見少許散在的出血點(diǎn)，包膜張力減輕。
　　2.肺組織病理?yè)p傷及評(píng)分
　　2.1 HE染色:UN組肺組織結(jié)構(gòu)完整正常;LPS組部分肺泡壁不同

10、程度的破壞或斷裂，肺微血管充血、出血、微血栓形成，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞壞死，與SOCS3fl/fl小鼠肺組織病理變化比較，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠肺組織的上述病理變化在各時(shí)間點(diǎn)均明顯加重;LLL12干預(yù)后肺組織損傷程度減輕。
　　2.2 肺病理評(píng)分:
　　LPS組肺組織病理評(píng)分明顯高于UN組，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠病理評(píng)分明顯高于SOCS3fl/fl小鼠;LL

11、L12干預(yù)后病理評(píng)分較LPS組下降，病理評(píng)分與HE染色肺組織損傷的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相似。
　　3.肺泡-動(dòng)脈氧分壓差P(A-a)O2
　　各時(shí)相LPS組P(A-a)O2明顯高于UN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠P(A-a)O2明顯高于SOCS3fl/fl/小鼠(P＜0.01)，LLL12干預(yù)后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肺組織氧合得到部分改善，與LPS組比較P(A-a)O2逐漸減少(P＜0.0

12、5)，但仍明顯高于UN組。
　　4.肺組織濕/干重比值(W/D)
　　LPS組肺組織W/D比值明顯高于UN組(P＜0.01)，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠W/D比值明顯高于SOCS3fl/fl小鼠(P＜0.01); LLL12干預(yù)后W/D比值較LPS組下降，與肺損傷病理評(píng)分的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相似。
　　5.BALF中白細(xì)胞總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+的比例:
　　LPS組白細(xì)胞

13、總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+比例較UN組進(jìn)行性增加;與LPS組對(duì)比，LLL12干預(yù)后白細(xì)胞總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+比例下降。
　　6.血清及BALF中TNF-α、IL-1β及CCL2的表達(dá)
　　LPS組血清及BALF中TNF-α、IL-1β及CCL2的濃度明顯高于UN組，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠中各炎癥細(xì)胞因子的增加幅度更為顯著;LLL12干預(yù)后TN

14、F-α、IL-1β及CCL2的濃度在24h、48h、72h及96h均低于LPS組，而在48h明顯低于LPS組，差異有顯著意義(P＜0.01），但均高于UN組。
　　7.Western blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞中STAT3的磷酸化水平
　　LPS刺激體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，STAT3的磷酸化水平增高，來(lái)源于LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠的巨噬細(xì)胞中STAT3活化程度明顯增強(qiáng);而應(yīng)用LLL12抑制STAT3的磷酸化后，TNF-

15、α、IL-1β和iNOS的表達(dá)均降低。
　　結(jié)論：
　　1.LPS誘導(dǎo)的ARDS中，STAT3信號(hào)通路的激活，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集增加，細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β)及趨化因子(CCL2)表達(dá)增加。
　　2.LLL12通過(guò)抑制STAT3的激活，下調(diào)細(xì)胞因子及趨化因子的表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集，肺組織損傷減輕，為ARDS的治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　3.條件性敲除STAT3活化的負(fù)