金欣口服液及白藜蘆醇對RSV活化誘導的TLR3及其信號通路的調控作用.pdf

1、小兒肺炎是兒科最常見疾病之一，嚴重危害著兒童的健康，目前世界衛(wèi)生組織(WHO)將本病列為全球重要的三種兒科疾病之一，我國衛(wèi)生部也將其列為重點防治的兒科四大疾病之一。其中病毒性肺炎占小兒肺炎的一半左右，而呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialviral，RSV)又是病毒性肺炎中最常見的病原體，可以引起嬰幼兒毛細支氣管炎、支氣管肺炎、間質性肺炎等疾病。
　　 RSV感染的發(fā)病機制目前尚未完全明確，且缺乏安全有效的疫

2、苗及治療手段，而中醫(yī)藥在治療病毒感染性疾病方面有著獨到的優(yōu)勢。金欣口服液是臨床治療小兒病毒性肺炎痰熱閉肺證的常用有效制劑，具有開肺化痰解毒的功效，且前期大量實驗研究已證實其具有一定的抗RSV活性及免疫調節(jié)作用。白藜蘆醇是金欣口服液組成藥物虎杖的主要有效成分之一，大量文獻報道證實其具有一定的抗炎抗病毒活性。
　　 Toll樣受體（toll-likereceptors，TLRs）屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，是重要的模式識別受體(patte

3、rnrecognitionreceptors，PRRs)之一，可以識別不同微生物的病原相關分子模式(pathogenassociatedmoleculepatten,PAMP)。RSV是單股負鏈RNA病毒，在復制及轉錄過程中會合成大量雙鏈RNA(dsRNA)，故能被識別dsRNA的TLR3所特異性識別，通過一系列信號傳導途徑，引起下游細胞因子的大量分泌，引起系統(tǒng)性炎癥反應。鑒于中醫(yī)藥作用的多靶點性，本實驗從Toll樣受體3及其介導的信號

4、通路入手，探討了金欣口服液及其有效組分白藜蘆醇的抗RSV感染機理。
　　 目的：
　　 研究金欣口服液及白藜蘆醇對RSV活化誘導的TLR3及其信號傳導通路的調控作用，探討其治療RSV肺炎的可能免疫學機制。
　　 方法：
　　 體外實驗：RSV感染體外培養(yǎng)的RAW264.7細胞，采用金欣口服液含藥血清及白藜蘆醇進行干預，24h后收集細胞，RealtimeRT-PCR法測定TLR3及其信號通路關鍵分子TRIF

5、、TRAF6mRNA的表達變化；激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光細胞化學染色法處理的各組細胞TLR3蛋白表達情況；ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α含量。
　　 體內實驗：RSV滴鼻感染BALB/c小鼠，金欣口服液及白藜蘆醇進行干預，并于首次滴鼻后24、72、144h，取各組小鼠肺組織，分別行病理組織切片評價肺部病變情況，RealtimeRT-PCR法檢測肺組織中TLR3、TRIF及TRA

6、F6mRNA表達情況，蛋白免疫印跡法(westernblot)檢測各組小鼠肺組織TLR3蛋白表達情況；取各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，ELISA法檢測IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α表達情況。
　　 結果：
　　 體外實驗：
　　 1．RSV感染RAW264.7細胞后24h，TLR3mRNA表達量明顯升高(與正常組比較，P＜0.01)，金欣口服液含藥血清組TLR3mRNA表達量較RSV感染組顯

7、著降低(P＜0.01)，各濃度白藜蘆醇組TLR3mRNA表達量較RSV感染組均有不同程度降低（P＜0.01）；RSV感染RAW264.7細胞后24h，TRIF、TRAF6mRNA表達量較正常組均略有升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，金欣口服液含藥血清及各濃度白藜蘆醇組TRIF、TRAF6mRNA表達量與RSV感染組比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 2．RSV感染RAW264.7細胞后24h，TLR3蛋白表達量較正

8、常組明顯升高（P＜0.01）；金欣口服液含藥血清組TLR3蛋白表達量較RSV感染組明顯降低(P＜0.01)；各濃度白藜蘆醇組無論是預防給藥還是治療給藥TLR3蛋白表達量較RSV組均有不同程度降低(P＜0.01)。
　　 3．RSV感染RAW264.7細胞后24h，細胞培養(yǎng)上清中IL-1β未檢測出；IL-6、TNF-α表達量明顯升高（與正常組比較，P＜0.01），金欣口服液含藥血清組IL-6(P＜0.05)、TNF-α（P＜0.0

9、1）表達量較RSV感染組顯著降低，各濃度白藜蘆醇組IL-6、TNF-α表達量較RSV感染組均不同程度降低；IFN-β表達量有所升高（與正常組比較，P＜0.01），金欣口服液含藥血清及各濃度白藜蘆醇組IFN-β表達量較RSV組比較均不同程度增高。
　　 體內試驗：
　　 1．RSV感染BALB/c小鼠后肺部病理改變主要表現為肺間質炎，肺泡壁血管擴張充血，水腫增厚，肺泡壁及間質有炎細胞浸潤；肺泡腔基本清晰，無明顯滲出物；支氣

10、管上皮細胞無明顯變性、壞死，管腔內無明顯炎性滲出物。肺部病變程度在24h最輕，隨著感染時間的推移，病變程度逐漸加重。金欣口服液及白藜蘆醇組小鼠肺內炎癥程度均有不同程度減輕，病理評分結果顯示治療組各時間點與模型組比較均有統(tǒng)計學顯著性差異。
　　 2．RSV感染BALB/c小鼠后24h，肺組織中TLR3mRNA表達量顯著增高（與正常組比較，P＜0.01），隨著感染時間的延長，TLR3mRNA的表達量逐漸下降。RSV感染后24h，金欣

11、口服液和白藜蘆醇組TLR3mRNA表達量較RSV感染組不同程度降低（P＜0.01），但隨著感染時間的延長，金欣口服液等效劑量組TLR3mRNA表達量較RSV感染組有所增高，而金欣高劑量組和白藜蘆醇組TLR3mRNA表達量較RSV感染組無差異(P＞0.05)。
　　 3．RSV感染BALB/c小鼠后24、72、144h，肺組織中TRIF、TRAF6mRNA表達量與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，金欣口服液和白藜蘆醇組小

12、鼠肺組織TRIF、TRAF6mRNA表達量與RSV感染組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4．RSV感染BALB/c小鼠后24h，肺組織內TLR3蛋白表達量較正常組高(P＜0.01)，72h表達達到高峰，后逐漸下降。金欣口服液及白藜蘆醇組TLR3表達量于24h和72h均較RSV感染組不同程度降低（P＜0.01），感染144h時金欣口服液等效劑量及白藜蘆醇組TLR3表達量較RSV組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

13、r>　　 5．RSV感染BALB/c小鼠后24h，BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α表達量均明顯升高（與正常組比較，P＜0.01），隨著感染時間的延長，BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α表達量均逐漸下降；RSV感染后24h，金欣口服液和白藜蘆醇組小鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α表達量均較感染組顯著下降，隨著感染時間的延長，金欣等效劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α表達較感染組有所上升，而金欣高劑量組和

14、白藜蘆醇組無上升趨勢。RSV感染BALB/c小鼠后24h，BALF中IFN-β表達量與正常組比較無顯著性差異(P＞0.05)，隨著感染時間的延長，RSV組IFN-β表達量逐漸上升。RSV感染后24h，金欣口服液組和白藜蘆醇組IFN-β表達量較RSV組顯著上升(P＜0.01)，隨著感染時間的延長各給藥組IFN-β表達量與RSV組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 結論：
　　 1．金欣口服液及白藜蘆醇能夠顯著改善RS

15、V感染小鼠的肺部病變；
　　 2．金欣口服液及白藜蘆醇能夠從核酸和蛋白層面顯著抑制RSV感染早期過度活化的TLR3表達；
　　 3．金欣口服液及白藜蘆醇對TLR3信號通路關鍵分子TRIF、TRAF6mRNA表達無明顯的直接調控作用；
　　 4．金欣口服液及白藜蘆醇能夠顯著調控RSV感染初期TLR3介導的信號通路下游IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子的過量表達；隨著感染時間的延長，當上述炎癥因子表達下降