牛瑟氏泰勒蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測的相關(guān)研究方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、牛瑟氏泰勒蟲病是由泰勒科、泰勒屬的瑟氏泰勒蟲（T. sergenti）寄生于牛紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞引起的以高熱、貧血、出血、消瘦和體表淋巴結(jié)腫大為主要臨床癥狀的一種血液原蟲病。該病危害極為嚴(yán)重，可使病牛出現(xiàn)嚴(yán)重貧血、黃染和消瘦，母牛產(chǎn)后少奶或無奶，出生的小牛瘦弱、存活率低等癥狀，已給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本研究以高度保守的表面蛋白P33基因序列的一部分作為靶序列，通過PrimerExplorer3.0軟件設(shè)計(jì)LAMP引物。

2、對(duì)試驗(yàn)中溫度、鎂離子濃度、內(nèi)外引物濃度比和反應(yīng)時(shí)間等重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了牛瑟氏泰勒蟲P33基因的LAMP檢測方法，并進(jìn)行了應(yīng)用研究。結(jié)果表明，外引物濃度不變時(shí)，在鎂離子濃度為8mM和10mM，內(nèi)引物濃度為1.2μM-1.6μM時(shí)效果最好；以63℃作為參數(shù)，外引物終濃度0.2μM，經(jīng)限制性內(nèi)切酶ScaⅠ消化后出現(xiàn)114bp和129bp2條主帶；時(shí)間梯度結(jié)果顯示，最佳反應(yīng)時(shí)間為45min或60min。對(duì)梯度稀釋模板的檢測表明，T.S P

3、33-LAMP最低檢測量為0.23fg/μl，而普通PCR法只能檢測到23fg/μl；以弓形蟲、新孢子蟲、卵形巴貝斯蟲為模板未擴(kuò)增出條帶，說明該法具有較好的特異性；通過對(duì)4個(gè)地區(qū)84份牛血液樣本的臨床應(yīng)用表明，4個(gè)地區(qū)均為牛瑟氏泰勒蟲感染地區(qū)，陽性率最高達(dá)85.71％，不同性別間感染率差異顯著(P<0.05)，不同地區(qū)間差異極顯著（P<0.01）。本試驗(yàn)建立的牛瑟氏泰勒蟲LAMP檢測方法具有快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，完全