IGFBP7基因在K562細胞中的生物學效應用作用機制的探討.pdf

1、第一部分，IGFBP7基因慢病毒載體的構建及其在K562細胞的表達
　　 目的：構建IGFBP7（insulin-like growth factor binding protein 7）基因的慢病毒載體，為研究該基因在白血病中的功能提供基礎。
　　 方法：采用限制性內切酶酶切獲得目的基因，基因重組構建慢病毒載體質粒venus-/GFBP7，用293T細胞包裝慢病毒顆粒感染K562細胞，并采用多種方法鑒定。
　　

2、 結果：所獲IGFBP7基因經(jīng)測序與GenBank比對序列一致。慢病毒載體質粒venus-/GFBP7經(jīng)BamH1酶切鑒定片段大小正確。熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測到GFP在293T及K562細胞中表達，RT-PCR和Western blot檢測到IGFBP7在K562細胞表達。
　　 結論：本課題成功構建帶有IGFBP7基因的慢病毒載體，為研究IGFBP7基因在K562細胞中的功能奠定了基礎。
　　 第二部分，IGFBP

3、7基因在K562細胞中的生物學功能研究
　　 目的：通過成功構建IGFBP7-K562細胞穩(wěn)定表達株，觀察IGFBP7基因對白血病細胞株K562細胞增殖、細胞周期、穿膜等生物學行為的影響，初步探討IGFBP7基因在AML中的生物學功能。
　　 方法：通過CCK-8法及細胞集落實驗觀察IGFBP7對細胞增殖的影響。利用ELISA方法檢測穩(wěn)定轉染株培養(yǎng)上清中IGBP7的表達及觀察上述細胞培養(yǎng)上清對未轉染K562細胞增殖的影響

4、。通過流式分析細胞周期的變化及利用RT-PCR方法和Western Blot方法檢測cyclinD1的表達。通過穿膜實驗檢測IGFBP7基因對K562細胞穿膜能力的影響。
　　 結果：通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)在第二天IGFBP7轉染株相對于空載體載體轉染組明顯升高（升高23％），集落形成數(shù)量及大小IGFBP7轉染組也明顯高于空載體組(39±4vs26±6，P＜0.05)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)IGFBP7轉染株組細胞培養(yǎng)上清中IGFB

5、P7表達水平明顯高于空載體組及陰性對照組（76.37±2.19μg/Lvs63.52±2.29μg/Land60.31±0.24μg/L，P=0.0001），而且該培養(yǎng)上清具有促進未轉染K562細胞增殖的能力（IGFBP7轉染株上清組VS空載體轉染株上清組：140%上升；d2;P＜0.05）。IGFBP7轉染株組細胞周期G0/G1期比例下降至35.34%±3.36%，而S期升至56.08%±1.85%，相對空載體轉染組具有明顯意義(P＜

6、0.05)，同時cyclinDlmRNA水平及蛋白水平在IGFBP7轉染組均是升高的。細胞穿膜實驗表明IGFBP7轉染株組穿膜能力較對照組（空載體組及未轉染細胞組）明顯升高(18080±630vs4250±653vs5388±855;P＜0.05)。
　　 結論：IGFBP7基因具有促進細胞的增殖、周期進展及穿膜能力，從而產(chǎn)生癌基因樣作用。
　　 第三部分，IGFBP7基因在K562細胞中分子機制探討
　　 目的

7、：為了進一步明確IGFBP7在K562細胞中引起的一系列生物學功能變化的具體分子機制，我們通過基因芯片及western blot方法，從基因組與蛋白組水平來探索的該基因分子效應作用機制。
　　 方法：通過基因芯片技術篩選出IGFBP7轉染株與空載體轉染株差異表達基因，利用定量PCR及western blot技術進一步驗證。定量PCR法檢測IGFBP7和AKT3基因在40例初診急性髓細胞白血病的表達情況，通過相關性分析兩基因間的相

8、關性。通過小分子抑制劑進一步觀察細胞生物學特征的改變。
　　 結果：基因芯片篩選出10個差異表達基因進行定量PCR驗證，其中包括AKT3，結果發(fā)現(xiàn)芯片結果與定量PCR結果趨勢完全一致，證實了我們芯片結果的可靠性。同樣在IGFBP7轉染株組中AKT3總蛋白表達水平及磷酸化水平亦升高。IGFBP7和AKT3基因在40例初診急性髓細胞白血病患者中表達量具有明顯相關性(r=0.505，P=0.001)。利用AKT抑制劑(tricirib