新生鼠皮膚表皮細胞牙源性上皮方向分化的實驗研究.pdf

1、牙齒的發(fā)生和發(fā)育是由上皮和間充質在一系列信號分子組成的信號網(wǎng)絡的精確調控下完成的。因此牙齒的生物性再生至少需要兩種細胞：上皮源性細胞和間充質源性細胞。目前牙源性間充質細胞的替代研究進展較快而且取得了可喜的成績，例如成體的牙髓干細胞、骨髓基質細胞均被證明具有形成牙髓-牙本質復合體的功能。在尋找牙源性上皮細胞替代細胞方面雖然也進行了一些研究，如誘導胚胎時期口腔粘膜上皮或皮膚表皮以及成體骨髓來源的細胞向成釉細胞轉化，但這些研究多建立在應用胚胎

2、早期組織基礎之上，以出生后組織為來源尋找替代細胞的研究進展有限。尋找能夠向牙源性上皮方向分化的成體或出生后組織來源的細胞對解決牙齒再生研究中上皮源性種子細胞來源的瓶頸問題具有重要意義。本研究著重探討出生后1d 仔鼠的皮膚來源的表皮細胞向牙源性上皮方向分化以及參與牙齒發(fā)育的能力。本課題主要進行了以下幾方面的研究： 1. 牙乳頭間充質細胞對皮膚表皮細胞牙向分化的體外誘導研究 （1）皮膚表皮細胞的體外培養(yǎng)與鑒定以出生1d

3、的SD 仔鼠背部皮膚為組織來源進行表皮細胞培養(yǎng)。采用胞外基質的黏附法對原代培養(yǎng)的表皮細胞進行篩選，對篩選細胞的增殖能力、細胞表型以及細胞周期的特性進行分析。 結果表明所經傳代培養(yǎng)所得到的細胞具有良好的生物學特性，能夠表達表皮干細胞相對特異性標識物CK19、CK14；流式細胞周期分析顯示所培養(yǎng)的細胞多數(shù)處于G0/G1 期。上述檢測結果表明本實驗所培養(yǎng)的表皮細胞中未分化細胞的含量較多。 （2）牙乳頭間充質細胞的體外培養(yǎng)采

4、用顯微分離法分離出生后1d SD仔鼠下頜第一磨牙的牙乳頭，免疫組織化學染色結果表明分離獲得的牙乳頭組織中沒有牙源性上皮的殘余。采用酶消化法進行牙乳頭間充質細胞（DPMCs）的原代培養(yǎng)并對細胞的純度、表型、增殖能力以及礦化能力等特性進行分析。 結果表明分離培養(yǎng)的DPMCs 沒有上皮性標記物pan-CKs 的表達，但卻能夠穩(wěn)定的表達VIM，RT-PCR 分析顯示所培養(yǎng)的DPMCs 沒有牙源性上皮特異性基因AMGN、AMBN 的表達

5、。進一步檢測結果表明DPMCs 具有較強的增殖能力和礦化誘導液誘導后分泌礦化基質的能力。結果證明本研究所獲得的DPMCs 沒有上皮細胞污染、具有較強增殖活性和礦化能力。 （3）牙乳頭間充質細胞對表皮細胞牙向分化的體外誘導研究通過分層培養(yǎng)建立牙乳頭間充質細胞對表皮細胞牙向分化的體外誘導模型，以牙胚細胞條件培養(yǎng)液為輔助誘導液對表皮細胞進行牙向分化誘導。結果表明經過體外6d 的培養(yǎng),表皮細胞能夠表達牙源性上皮標記物AMBN,AMGN

6、 基因。進一步免疫細胞化學染色分析表明這些細胞能夠穩(wěn)定表達CK14，從而說明在該誘導條件下表皮細胞能夠向牙源性上皮方向分化而不是向角質細胞方向分化。該誘導方案的建立為尋找非牙源性上皮細胞替代牙源性上皮細胞的研究奠定了實驗基礎。 2. 牙乳頭間充質細胞對皮膚表皮細胞牙向分化的體內誘導研究 （1）表皮細胞與牙乳頭間充質細胞相互作用誘導模式的篩選建立了間充質細胞團塊與表皮皮片、間充質細胞與表皮細胞混合接種支架材料、間充質細

7、胞團塊與表皮細胞團塊分層組合、間充質細胞與表皮細胞混合細胞團塊4 種不同的牙齒再生上皮-間充質間的重組方案，培養(yǎng)14d 后的結果表明間充質與表皮細胞混合團塊培養(yǎng)體系中可以觀察到類牙齒樣結構，而其他三組中均無此類結構的形成。本實驗最終篩選間充質細胞與表皮細胞混合團塊體內培養(yǎng)的方法作為皮膚表皮細胞與牙乳頭間充質細胞相互作用的體內誘導模式。 （2）牙乳頭間充質細胞對表皮細胞牙向分化的體內誘導研究采用間充質細胞與表皮細胞/組織混合團塊

8、體內培養(yǎng)的重組方案，分別將出生1d 仔鼠的表皮皮片/細胞與原代的DPMCs 按1;2 的體積比混合重組后形成細胞團塊，同時設立單純的皮膚表皮皮片、表皮細胞和單純的牙乳頭間充質組織、DPMCs移植作為陰性對照。體內培養(yǎng)14d 后進行組織學、免疫組織化學分析，結構顯示，表皮皮片與DPMCs 的重組體中可見由釉質、成釉細胞、牙本質、前期牙本質已及成牙本質細胞構成的不規(guī)則的牙齒樣結構，表皮細胞與DPMCs 形成的重組體中可見具有一定牙冠形態(tài)的牙

9、胚樣結構。進一步免疫組織化學染色分析和PKH26 熒光標記均顯示釉質形成細胞為皮膚來源的細胞。本實驗首次證明了來自出生后1d 的SD 仔鼠皮膚的表皮細胞在一定的誘導條件下能夠向牙源性上皮方向轉化，同時還證明了本研究中所采用的誘導方法能夠有效的促進皮膚表皮細胞向牙源性上皮方向轉化。 （3）牙乳頭間充質細胞對出生后不同時間點皮膚表皮牙向分化的體內誘導研究分別取出生后4d、7d 的仔鼠的背部表皮，將其與出生1d 的仔鼠的DPMCs

10、混合制備成細胞團塊，經體內培養(yǎng)后進行組織學觀察。結果表明2 組重組體中均無釉質樣結構的形成。本實驗表明在同1d 仔鼠表皮相同的誘導條件下，4d 及7d 仔鼠的表皮不具備向牙源性上皮方向轉化的能力。 3. 牙髓間充質對皮膚表皮細胞牙向分化的體內誘導研究 （1）牙乳頭間充質細胞與牙髓干細胞生物學行為及成牙本質能力的比較研究采用有酶消化法及有限稀釋的方法進行大鼠牙髓干細胞（DPSCs）的原代培養(yǎng)，并將所獲得的DPSCs 與

11、DPMCs 進行增殖能力、體外礦化能力、體內形成牙本質能力的比較，結果顯示DPSCs 具有與DPMCs 相似的增殖能力、礦化和形成牙本質的能力。 （2）牙髓間充質對出生1 天仔鼠皮膚表皮細胞牙向分化的體內誘導研究通過分別建立牙髓干細胞、牙髓中1/3、牙髓根尖1/3 組織與出生1d 仔鼠表皮細胞的重組體觀察牙髓間充質對表皮來源細胞牙源性上皮方向分化的誘導能力。將上述重組體體內培養(yǎng)14d 后組織學結果顯示3 組中均無牙釉質樣結構的

12、形成。本部分實驗結果證明雖然牙髓間充質來源于牙胚間充質且具有同DPMCs 相似的形成牙本質-牙髓復合體的能力，但在對非牙源性上皮牙向分化誘導能力方面存在較大差異。 綜上所述，本研究首次證明了出生后1d SD 仔鼠皮膚來源的表皮細胞在出生后1d 的SD 仔鼠的DPMCs 的誘導下能夠向牙源性上皮方向分化。相同的誘導模式下，牙髓間充質的誘導不能使皮膚來源的表皮細胞實現(xiàn)牙向分化。 本研究為牙齒再生研究走向臨床奠定良好的實驗