骨髓源及脂肪源干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化的比較實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，干細(xì)胞移植已經(jīng)成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nerve system，CNS）損傷特別是脊髓損傷（spinal cord injury，scD后功能恢復(fù)研究的熱點(diǎn)。適合進(jìn)行移植的細(xì)胞有成體間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）以及嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、雪旺氏細(xì)胞（schwan

2、n cells，SCs）等。主要機(jī)理在于，移植的細(xì)胞可以在CNS的神經(jīng)組織內(nèi)長(zhǎng)期存活，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、改善損傷區(qū)局部微環(huán)境，替代變性壞死的神經(jīng)細(xì)胞，從而促進(jìn)受損傷神經(jīng)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)，其中ESCs取材困難、且涉及免疫排斥和倫理道德等問(wèn)題；而MSCs來(lái)源豐富、取材方便、適合自體移植而不受倫理約束、且沒(méi)有免疫排斥反應(yīng)，具有高度自我更新和多向分化能力，故被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)研究。 第一部分 ADSCs和BMSCs的取材與傳代培養(yǎng)。

3、 目的:建立獲取、傳代培養(yǎng)及初步鑒定大鼠ADSCs和BMSCs的技術(shù)體系，為下一步誘導(dǎo)分化及其比較實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。 方法:1.ADSCs的取材、傳代采用酶消化法分離ADSCs。主要步驟：無(wú)菌麻醉?xiàng)l件下取SD成年大鼠的腹部脂肪組織，剪碎后用2.5%的Ⅰ型膠原酶37℃條件下消化60nun；之后1200rpm離心8min，棄去上層的脂肪和中間的液體，將底部的細(xì)胞重懸、以1200rpm離心8min后棄去上清，加入5ml含10%FBS

4、的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于底面積25c㎡的一次性培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、37℃、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每周換液2次。貼壁細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)按1：3傳代。共傳5代以后進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。 2.BMSCs的取材、傳代采用全骨髓培養(yǎng)的方法分離BMSCs。主要步驟：無(wú)菌麻醉?xiàng)l件下取同一只成年SD大鼠的股骨和脛骨，用DMEM/F12培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，獲得的細(xì)胞懸液經(jīng)1000rpm離心8min后棄去上清，加入5ml含10

5、%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于底面積25c㎡的一次性培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、37℃、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d后棄去未貼壁細(xì)胞；每周換液2次。貼壁細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)按1：3傳代。共傳5代以后進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)。 3.干細(xì)胞特征檢測(cè)：以CD44為一抗對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。以CD29、CD34、CD44、CD90為細(xì)胞表型對(duì)第5代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分別確定ADSCs和BMSCs的干細(xì)胞特征。

6、 結(jié)果:原代BMSCs于2d后貼壁，7d后90%融合；傳代細(xì)胞的增殖潛伏期明顯變短，達(dá)到90%融合需要5d左右；第5代細(xì)胞均勻一致。原代ADSCs于1d后貼壁，9d90%融合；傳代細(xì)胞的潛伏期明顯變短，達(dá)到90%融合需要5d左右；倒置相差顯微鏡下可觀察到第5代細(xì)胞形態(tài)均勻一致，呈梭形，排列比第5代BMSCs稍整齊。經(jīng)CD44免疫細(xì)胞化學(xué)和以CD29、CD34、CD44、CD90為細(xì)胞表型的流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)其具有干細(xì)胞特征。

7、討論及結(jié)論:采用酶消化法獲得的ADSCs和經(jīng)過(guò)貼壁法所獲得的BMSCs，在傳至第5代時(shí)、細(xì)胞形態(tài)一致，排列整齊；經(jīng)鑒定，傳代后的ADSCs和BMSCs仍擁有干細(xì)胞特征，適合進(jìn)一步誘導(dǎo)分化研究。 第二部分 ADSCs和BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 目的:比較傳代培養(yǎng)至第5代的ADSCs和BMSCs在分別加入“bFGF+ EGF”之后的誘導(dǎo)分化規(guī)律，以及兩種細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的差異。 方法:對(duì)傳代培養(yǎng)至

8、第5代的ADSCs和BMSCs，以含有0.5%胎牛血清的DMEM/F12，加入10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、20 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）進(jìn)行誘導(dǎo)分化。3d后補(bǔ)充一次因子，7d換液，細(xì)胞90%融合后按1：2傳代。用Western blot和免疫組化法觀察誘導(dǎo)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、72h、1

9、w、2w）細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)標(biāo)志物（Nestin、β-tubulinⅢ、GFAP）的情況，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。觀察誘導(dǎo)1w后細(xì)胞在掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）下的形態(tài)學(xué)特征。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析照片由CCD成像系統(tǒng)獲得。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：選取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)取10個(gè)不重疊視野（200×），選取100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。陽(yáng)性率用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；比較兩種來(lái)源細(xì)胞（ADS

10、Cs和BMSCs）同一個(gè)時(shí)期同一種染色的陽(yáng)性率采用“獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)”；兩種細(xì)胞同一種染色隨時(shí)間變化規(guī)律采用“單向方差分析”。統(tǒng)計(jì)軟件用SPSS（版本13.0）、P<0.05為有顯著性差異、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果:誘導(dǎo)前，ADSCs和BMSCs中的少量細(xì)胞呈Nestin陽(yáng)性染色，顯微鏡觀察亦有少量神經(jīng)元樣細(xì)胞存在；誘導(dǎo)后，ADSCs和BMSCs均分化出更多的神經(jīng)元樣細(xì)胞，但其中由BMSCs分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞突起更長(zhǎng)，誘導(dǎo)后72h，

11、誘導(dǎo)細(xì)胞相連形成網(wǎng)狀。具體變化：給予bFGF+EGF誘導(dǎo)6h后，兩種細(xì)胞即出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上的改變，即誘導(dǎo)分化后的BMSCs（differentiated BMSCs，dBMSCs）和誘導(dǎo)分化后的ADSCs（differentiated ADSCs，dADSCs）開(kāi)始收縮、形成胞體呈圓形的多突起細(xì)胞，表達(dá)Nestin陽(yáng)性的dADSCs和dBMSCs分別迅速增至75.2±2.8和55.2±2.8。隨著誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)延長(zhǎng)、Nestin陽(yáng)性的細(xì)胞在dA

12、DSCs和dBMSCs的表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，誘導(dǎo)72h和1w后，dADSCs和dBMSCs均檢測(cè)不到Nestin陽(yáng)性細(xì)胞；誘導(dǎo)后24h，dADSCs和dBMSCs表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulinⅢ，其陽(yáng)性率均在誘導(dǎo)1w時(shí)達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)水平，并保持到2w；同時(shí)，dADSCs和dBMSCs都很少分化為表達(dá)GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞。 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，dADSCs隨時(shí)間變化的Nestin陽(yáng)性表達(dá)漸少（F=1877.764，P=0.000）、β-

13、tubulinⅢ陽(yáng)性表達(dá)漸增（F=882.435，P=0.000）趨勢(shì)，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)，dBMSCs隨時(shí)間變化的Nestin陽(yáng)性表達(dá)漸少（F=2158.746，P=0.000）和β-tubulinⅢ陽(yáng)性表達(dá)漸增（F=1800.764，P=0.000）趨勢(shì)亦具有顯著性差異（P<0.05）。由此提示，本研究采用的誘導(dǎo)方法可以成功地將ADSCs和BMSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞。而經(jīng)過(guò)ADSCs和BMSCs在誘導(dǎo)后不同時(shí)間

14、點(diǎn)同一種染色陽(yáng)性率的比較，均顯示為P<0.05，提示每種染色陽(yáng)性率的變化在不同時(shí)間點(diǎn)都有顯著性差異、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中dADSCs隨誘導(dǎo)時(shí)間遞增而表達(dá)β-tubulinⅢ逐漸增強(qiáng)的能力（24h、72h、1w、2w分別為35.0±6.4、62.7±2.2、87.0±2.5、83.2±5.1）明顯大于dBMSCs（24h、72h、1w、2w分別為10.1±2.7、46.5±2.4、68.6±5.1、70.5±3.8），表明dADSCs向神

15、經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力、比dBMSCs更強(qiáng)。Western blot結(jié)果也支持上述推論。 討論及結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，經(jīng)過(guò)特定細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，ADSCs和BMSCs可以發(fā)生形態(tài)學(xué)和表型的變化，分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。在誘導(dǎo)前，Nestin和GFAP在ADSCs和BMSCs呈低水平表達(dá)，而β-tubulinⅢ隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，在dADSCs和dBMSCs中逐漸呈顯著表達(dá)趨勢(shì)，提示在本實(shí)驗(yàn)條件下，dADSCs和dBMSCs隨著誘導(dǎo)時(shí)間的

16、遞增而逐漸趨向于向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種來(lái)源的MSCs，雖經(jīng)bFGF和EGF誘導(dǎo)、卻仍極少分化為GFAP陽(yáng)性的細(xì)胞，在提示ADSCs和BMSCs具有一定可塑性的同時(shí)、也提示了微環(huán)境對(duì)這兩種干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的影響作用。 由ADSCs和BMSCs在相同誘導(dǎo)條件下出現(xiàn)顯著差異的分化結(jié)果可以推測(cè)，dADSCs分化為β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞的能力更強(qiáng)，與BMSCs相比、ADSCs