IRS-1通過miR-143調(diào)節(jié)前脂肪細胞分化的作用與機制研究.pdf

1、目的：
　　了解間充質(zhì)干細胞(MSC)向成脂細胞分化的機制，是多種代謝性疾病防治研究取得突破的關(guān)鍵之一。我們前期研究表明胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）能調(diào)節(jié)MSC向成骨細胞與脂肪細胞分化，建立了IRS-1基因剔除小鼠，找出了IRS-1基因剔除前后的骨髓基質(zhì)細胞差異miRNA表達譜和基因表達譜。本研究將在此基礎(chǔ)上進一步探討IRS-1調(diào)節(jié)前脂肪細胞分化的具體機制及應(yīng)用。

2、　　方法：
　　提取IRS-1純合子、雜合子和野生型小鼠的脂肪、肝臟及骨骼肌組織，采用RT-qPCR檢測miR-143在小鼠組織中的表達水平。克隆靶基因胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factors-1receptor，IGF1R)的3'-非編碼區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)的miR-143結(jié)合序列及其結(jié)合位點突變序列，并插入熒光素酶報告基因載體，合成miRNA

3、mimics、miRNA抑制子，與報告基因載體共轉(zhuǎn)染細胞，采用RT-qPCR法分析熒光素酶活性的變化。誘導(dǎo)3T3-L1細胞成脂分化，采用Western-blot技術(shù)檢測靶基因IGF1R在誘導(dǎo)過程中的蛋白質(zhì)水平，RT-qPCR技術(shù)檢測IGF1RmRNA和miR-143的表達水平，分析miR-143和IGF1R在成脂細胞分化過程中的表達水平及兩者之間的關(guān)系;然后將miR-143 mimics和miR-143 inhibitor轉(zhuǎn)染至細胞中，

4、觀察前脂肪細胞脂滴分泌的變化。收集正常人群、代謝正常健康性者、代謝異常性肥胖者的血清，提取血清RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)檢測miR-143的表達水平，比較3組之間的表達差異。
　　結(jié)果：
　　課題組通過分離IRS-1-/-小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，抽提蛋白、RNA，結(jié)合分析miRNA芯片、PCR芯片和miRNA靶基因預(yù)測軟件的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-143的靶分子包含IGF1R，我們利用RT-qPCR法檢測miR

5、-143在IRS-1純合子、雜合子和野生型小鼠的脂肪、肝臟及骨骼肌組織中的表達水平，結(jié)果顯示miR-143在IRS-1-/-小鼠組織中表達下調(diào)，與miRNA芯片結(jié)果一致。由此我們通過雙熒光素酶報告基因分析以及突變后的熒光素酶報告基因分析，發(fā)現(xiàn)miR-143mimics能夠顯著抑制熒光素酶的活性，而miR-143抑制子能使熒光素酶活性增強，突變后miR-143抑制能力受到抑制，確認(rèn)了IGF1R受miR-143的強效調(diào)控，為miR-143的

6、靶基因，可能參與了IRS-1對脂代謝的復(fù)雜調(diào)控。為了對此進一步驗證，我們采用Western-blot技術(shù)和RT-qPCR技術(shù)檢測miR-143和IGF1R在誘導(dǎo)前脂肪細胞分化過程中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)3T3-L1成脂過程中，隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，IGF1R的蛋白表達水平逐漸增加，并在第6天達到高峰，第9天略有下降;miR-143水平呈上升趨勢，而IGF1RmRNA與其相反，表達呈下降趨勢，我們得出結(jié)論miR-143在脂肪細胞分化中表達上

7、調(diào)，其靶基因IGF1R表達下調(diào);然后我們將miR-143 mimics和miR-143 inhibitor轉(zhuǎn)染至細胞中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-143 mimics組細胞的脂滴明顯多于inhibitor組。另外，我們收集了正常人群、代謝正常健康性肥胖者、代謝異常性肥胖者的血清，采用RT-qPCR技術(shù)比較miR-143的表達差異，發(fā)現(xiàn)與正常人群相比，miR-143在代謝正常健康性肥胖者表達較多。
　　結(jié)論：
　　1.IRS-1基因剔