IRS-1通過miR-143調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　了解間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)向成脂細(xì)胞分化的機(jī)制，是多種代謝性疾病防治研究取得突破的關(guān)鍵之一。我們前期研究表明胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）能調(diào)節(jié)MSC向成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化，建立了IRS-1基因剔除小鼠，找出了IRS-1基因剔除前后的骨髓基質(zhì)細(xì)胞差異miRNA表達(dá)譜和基因表達(dá)譜。本研究將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討IRS-1調(diào)節(jié)前脂肪細(xì)胞分化的具體機(jī)制及應(yīng)用。

2、　　方法：
　　提取IRS-1純合子、雜合子和野生型小鼠的脂肪、肝臟及骨骼肌組織，采用RT-qPCR檢測(cè)miR-143在小鼠組織中的表達(dá)水平?？寺“谢蛞葝u素樣生長(zhǎng)因子-1受體(insulin-like growth factors-1receptor，IGF1R)的3'-非編碼區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)的miR-143結(jié)合序列及其結(jié)合位點(diǎn)突變序列，并插入熒光素酶報(bào)告基因載體，合成miRNA

3、mimics、miRNA抑制子，與報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用RT-qPCR法分析熒光素酶活性的變化。誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞成脂分化，采用Western-blot技術(shù)檢測(cè)靶基因IGF1R在誘導(dǎo)過程中的蛋白質(zhì)水平，RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)IGF1RmRNA和miR-143的表達(dá)水平，分析miR-143和IGF1R在成脂細(xì)胞分化過程中的表達(dá)水平及兩者之間的關(guān)系;然后將miR-143 mimics和miR-143 inhibitor轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，

4、觀察前脂肪細(xì)胞脂滴分泌的變化。收集正常人群、代謝正常健康性者、代謝異常性肥胖者的血清，提取血清RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-143的表達(dá)水平，比較3組之間的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　課題組通過分離IRS-1-/-小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，抽提蛋白、RNA，結(jié)合分析miRNA芯片、PCR芯片和miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-143的靶分子包含IGF1R，我們利用RT-qPCR法檢測(cè)miR

5、-143在IRS-1純合子、雜合子和野生型小鼠的脂肪、肝臟及骨骼肌組織中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-143在IRS-1-/-小鼠組織中表達(dá)下調(diào)，與miRNA芯片結(jié)果一致。由此我們通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析以及突變后的熒光素酶報(bào)告基因分析，發(fā)現(xiàn)miR-143mimics能夠顯著抑制熒光素酶的活性，而miR-143抑制子能使熒光素酶活性增強(qiáng)，突變后miR-143抑制能力受到抑制，確認(rèn)了IGF1R受miR-143的強(qiáng)效調(diào)控，為miR-143的

6、靶基因，可能參與了IRS-1對(duì)脂代謝的復(fù)雜調(diào)控。為了對(duì)此進(jìn)一步驗(yàn)證，我們采用Western-blot技術(shù)和RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)miR-143和IGF1R在誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化過程中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)3T3-L1成脂過程中，隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，IGF1R的蛋白表達(dá)水平逐漸增加，并在第6天達(dá)到高峰，第9天略有下降;miR-143水平呈上升趨勢(shì)，而IGF1RmRNA與其相反，表達(dá)呈下降趨勢(shì)，我們得出結(jié)論miR-143在脂肪細(xì)胞分化中表達(dá)上

7、調(diào)，其靶基因IGF1R表達(dá)下調(diào);然后我們將miR-143 mimics和miR-143 inhibitor轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR-143 mimics組細(xì)胞的脂滴明顯多于inhibitor組。另外，我們收集了正常人群、代謝正常健康性肥胖者、代謝異常性肥胖者的血清，采用RT-qPCR技術(shù)比較miR-143的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)與正常人群相比，miR-143在代謝正常健康性肥胖者表達(dá)較多。
　　結(jié)論：
　　1.IRS-1基因剔