MiR-124通過靶基因Bim調(diào)節(jié)MPTP帕金森病模型中細(xì)胞凋亡和自噬.pdf

1、本課題擬在MPTP帕金森病模型中研究miR-124的表達(dá)變化，并探討其是否參與調(diào)節(jié)帕金森病中多巴胺能神經(jīng)元凋亡和細(xì)胞自噬過程，是否具有神經(jīng)保護(hù)作用及具體機(jī)制。
　　第一章 miR-124在MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型中的表達(dá)及意義
　　目的:檢測(cè)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠和MPP+處理的SH-SY5Y細(xì)胞中miR-124的表達(dá)
　　方法:(1) MPTP連續(xù)腹腔注射5天構(gòu)建帕金森病小鼠模型，按最后一次注射MPTP后的不同

2、時(shí)間點(diǎn)分組，收集各組小鼠中腦組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR擴(kuò)增miR-124和U6。
　　結(jié)果:相比于正常組小鼠，MPTP給藥后所有時(shí)間點(diǎn)的小鼠中腦組織內(nèi)的miR-124表達(dá)水平均顯著性下降，miR-124原位雜交結(jié)果顯示在MPTP帕金森病小鼠中腦保留的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)的miR-124信號(hào)更弱。
　　結(jié)論:在MPTP誘導(dǎo)的帕金森病模型中，多巴胺能神經(jīng)元的miRNA-124表達(dá)在早期即發(fā)生了顯著性下降。

3、r>　　第二章 外源性miRNA-124對(duì)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病的神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的:探討miR-124是否對(duì)MPTP帕金森病小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法:以miR-124激動(dòng)劑在小鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-124，在MPTP注射前9天側(cè)腦室置管，1周后開始經(jīng)導(dǎo)管注射miR-124激動(dòng)劑，2天后再開始腹腔注射MPTP，實(shí)驗(yàn)分為正常小鼠組，正常小鼠陰性對(duì)照劑組，MPTP帕金森病小鼠陰性對(duì)照劑組，MPTP帕金森病小鼠miR-1

4、24激動(dòng)劑組，同樣在不同時(shí)間點(diǎn)收集中腦組織。以TH免疫組織化學(xué)染色評(píng)估黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，以高效液相色譜測(cè)定中腦組織多巴胺含量。
　　結(jié)果:經(jīng)側(cè)腦室注射miR-124后，相比于MPTP帕金森病小鼠陰性對(duì)照劑組，MPTP帕金森病小鼠激動(dòng)劑組內(nèi)的miR-124水平均顯著升高。相應(yīng)地，TH免疫組織染色信號(hào)顯著增強(qiáng);
　　結(jié)論:miR-124能有效的減輕MPTP帕金森病小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的缺失，減少中腦組織內(nèi)多巴胺

5、含量的下降，對(duì)于MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第三章 Bim是miR-124的一個(gè)靶基因
　　目的:預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-124的靶基因。
　　方法:(1)以Target Scan預(yù)測(cè)miR-124的靶基因;(2)構(gòu)建靶基因野生型和突變型熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，將質(zhì)粒和miR-124模擬物或陰性對(duì)照劑同時(shí)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，48小時(shí)后讀取熒光值，實(shí)驗(yàn)分為野生型質(zhì)粒miR-124陰性對(duì)照劑組、野生型質(zhì)粒miR

6、-124模擬物組、突變型質(zhì)粒miR-124陰性對(duì)照劑組和突變型質(zhì)粒miR-124模擬物組;
　　結(jié)果:(1) TargetScan軟件分析，發(fā)現(xiàn)人Bim的mRNA3'端非編碼序列內(nèi)有兩個(gè)miR-124的結(jié)合位點(diǎn)，且在物種間高度保守;(2)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR-124與Bim基因的3'端非編碼區(qū)相結(jié)合，相比于野生型質(zhì)粒miR-124陰性對(duì)照劑組，野生型質(zhì)粒miR-124模擬物組的熒光素酶效應(yīng)顯著下降;
　　結(jié)論:Bi

7、m基因是miR-124的一個(gè)靶基因，其表達(dá)受miR-124的調(diào)控。
　　第四章 miR-124通過Bim基因減輕MPTP帕金森病小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的凋亡及其機(jī)制
　　目的:探討miR-124是否能減輕MPTP帕金森病小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，并闡明具體機(jī)制。
　　方法:在MPTP注射前9天側(cè)腦室置管，1周后開始經(jīng)導(dǎo)管注射miR-124激動(dòng)劑，2天后再開始腹腔注射MPTP，實(shí)驗(yàn)分為正常小鼠組，正常小鼠陰性對(duì)照劑組

8、，MPTP帕金森病小鼠陰性對(duì)照劑組，MPTP帕金森病小鼠miR-124激動(dòng)劑組，收集MPTP注射后1天后各組的中腦組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成eDNA，RT-PCR定量分析Bim基因的表達(dá);收集MPTP注射4天后各組的中腦組織，分別提取總蛋白和線粒體蛋白，采用Western blot分析Bim、Puma、Noxa和Bid蛋白的表達(dá)和Bax蛋白在線粒體的表達(dá)，另外采用TH免疫組織染色聯(lián)合尼氏染色，依靠凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征對(duì)中腦黑質(zhì)區(qū)的凋亡

9、細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果:(1)相比于正常組小鼠，MPTP組小鼠一天后Bim基因mRNA增加了75％左右(1 vs1.757)。而在MPTP模型組內(nèi)，相比于陰性對(duì)照劑，miR-124激動(dòng)劑能顯著下降Bim mRNA的表達(dá)水平(1.757±0.213 vs1.226±0.118，95％置信區(qū)間:-1.046～-0.0153)。(2) MPTP造模引起了Bim蛋白表達(dá)水平顯著升高，并且miR-124激動(dòng)劑則能顯著減少M(fèi)PTP引起的Bim蛋

10、白表達(dá)增加(3.106±0.245 vs1.947±0.344，95％置信區(qū)間-2.022～-0.2966);MPTP并不能引起B(yǎng)H3-only蛋白Puma和Noxa的表達(dá)變化，只有Bid在MPTP造模后表達(dá)上升，但是miR-124激動(dòng)劑并不能拮抗MPTP引起的Bid表達(dá)上升。
　　結(jié)論:外源性補(bǔ)充miR-124能減輕MPTP帕金森病小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制為通過特異性的抑制Bim的表達(dá)，進(jìn)而減少Bax蛋白向線粒體轉(zhuǎn)位，

11、減輕線粒體外膜滲透，最終抑制神經(jīng)元凋亡。
　　第五章 miR-124調(diào)節(jié)MPTP帕金病中自噬功能障礙及機(jī)制
　　目的:研究miR-124是否能調(diào)節(jié)MPTP帕金病中自噬功能障礙，并研究其是否通過靶基因Bim起作用。
　　方法:(1) MPTP帕金森病模型構(gòu)建及分組，側(cè)腦室注射miR-124激動(dòng)劑方法同前，收集最后一次注射MPTP1天后各組的中腦組織，裂解組織提取總蛋白，以western blot分析自噬體分子標(biāo)記LC3Ⅱ

12、和溶酶體分子標(biāo)記LAMP1的表達(dá)。(2)設(shè)計(jì)Bim特異性siRNA，將對(duì)照劑，miR-124和si-Bim轉(zhuǎn)染進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞6小時(shí)后，以PBS或者M(jìn)PP+處理細(xì)胞24小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取RNA行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bim的表達(dá)，同時(shí)提取總蛋白和溶酶體蛋白，分別檢測(cè)總蛋白中LC3Ⅱ、LAMP1的表達(dá)和溶酶體內(nèi)Bax蛋白的表達(dá)，以lysotracker-red標(biāo)記溶酶體以評(píng)估溶酶體膜滲透。(3)以1mM MPP+或者PBS處理SH

13、-SY5Y24小時(shí)，收集細(xì)胞，提取總蛋白，以Beclin-1抗體免疫沉淀蛋白樣品，western blot檢測(cè)Bim表達(dá)，以評(píng)估Beclin-1與Bim的相互作用。
　　結(jié)果:①相比于正常小鼠，MPTP帕金森病模型組小鼠中腦組織LC3Ⅱ蛋白表達(dá)顯著增加（1±0 vs6.407±0.578）;在MPTP模型組內(nèi)，相比于陰性對(duì)照劑，miR-124激動(dòng)劑能顯著減少LC3Ⅱ蛋白表達(dá)（6.407±0.578 vs3.7±0.684;95％置

14、信區(qū)間-4.461～-0.9525）。同樣地，MPTP減少了40％左右溶酶體分子標(biāo)記LAMP1的表達(dá)(1±0vs0.620±0.064)，miR-124激動(dòng)劑能顯著降低溶酶體的缺失（0.620±0.064 vs0.927±0.047;95％置信區(qū)間0.1295～0.4838）;②相比于正常組細(xì)胞，siRNA-Bim和miR-124模擬物對(duì)Bim都有顯著的基因沉默作用(control vs miR-124模擬物，1±0vs0.5068±0

15、.07661，95％置信區(qū)間0.1992～0.7871; control vs siRNA-Bim,1±0 vs0.3856±0.09973,95％置信區(qū)間0.3204～0.9083）。在MPP+刺激下，siRNA-Bim和miR-124模擬物都能顯著減少M(fèi)PP+刺激引起的Bim表達(dá)上升（control vs miR-124模擬物，2.185±0.3350 vs1.232±0.1711，95％置信區(qū)間0.05941～1.847; con

16、trol vssiRNA-Bim，2.185±0.3350 vs0.6610±0.06937，95％置信區(qū)間0.6301～2.418);
　　結(jié)論:miR-124在MPTP帕金森病模型中通過抑制Bim蛋白的表達(dá)，減少Bax蛋白的溶酶體轉(zhuǎn)位，從而減輕溶酶體膜滲透，減少溶酶體缺失和自噬體堆積，改善MPTP引起的細(xì)胞自噬功能紊亂，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。
　　第六章 miR-124參與維持SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的基礎(chǔ)自噬水平
　　

17、目的:探討在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)抑制miR-124后細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平的變化。
　　方法:在SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-124抑制劑或陰性對(duì)照劑24小時(shí)后，收集細(xì)胞行Western blot或者電鏡檢測(cè)細(xì)胞基礎(chǔ)自噬水平。
　　結(jié)果:相比于陰性對(duì)照記組，miR-124抑制劑組Bim蛋白表達(dá)顯著升高(1±0 vs1.370±0.07234，p=0.0362);細(xì)胞內(nèi)自噬體分子標(biāo)記LC3Ⅱ表達(dá)顯著減少(1±0 vs0.68±0.0