Apelin-13通過激活ERK1-2、PI-3K-Akt信號通路對局灶性腦缺血再灌注小鼠發(fā)揮神經保護作用.pdf

1、腦卒中嚴重危害人類健康，影響人們生活質量。多年來，研究人員在腦卒中的防治方面做了大量工作，如積極抗凝、溶栓、急診介入以及微創(chuàng)手術等方法的開展，極大的改善了腦卒中患者的預后。盡管如此，仍有約75％的患者因病情嚴重或復雜、就診不及時等原因留有不同程度的后遺癥。因此，腦卒中的研究仍任重道遠。臨床上約30％的缺血性腦卒中患者由于溶栓治療或栓子自發(fā)向遠端推移，出現血管再通現象。血管再通將伴隨缺血再灌注損傷的發(fā)生。因此，深入研究缺血再灌注損傷機制，

2、開發(fā)具有抗缺血損傷作用的新藥物或是發(fā)現傳統(tǒng)藥物抗缺血損傷的新作用，成為近年來的研究熱點，以期為腦卒中的臨床治療提供新途徑和理論依據。
　　腦血管閉塞繼而血管再通伴隨著一系列病理生理事件，包括缺血期間ATP耗竭、乳酸堆積、酸中毒以及再灌注期間活性氧族的產生、一氧化氮的細胞毒作用等。神經元對缺血后氧、糖的改變十分敏感。針對缺血再灌注病理過程進行深入研究及干預，成為挽救缺血腦組織的關鍵。
　　近年來通過對神經保護劑的研究，一些天然

3、或合成的物質逐漸被發(fā)現和證實對缺血腦組織具有保護作用。在這些令人驚喜的作用被發(fā)掘的同時，更需要對其作用機制進行深入研究。只有通過多途徑的探索，對某種具有神經保護作用的物質進行全面了解，才有望為臨床新藥物的開發(fā)提供有力的理論依據。
　　血管緊張素受體AT1相關的受體蛋白(putative receptor protein relatedto the angiotensin receptor AT1，APJ)是1993年在人類基因中識

4、別出的一種G蛋白偶聯(lián)受體，當時被稱為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體。1998年人類利用反向藥理學方法，從牛胃分泌物中提取并純化出APJ的內源性配體(APJendogenous ligand，apelin)，命名為apelin。Apelin在人類主要存在于心臟、腎上腺、腎、肺的血管內皮和大血管內皮細胞，在肺、心肌細胞、腎、腎上腺分泌細胞、血管平滑肌細胞、神經細胞、脂肪組織和結締組織中也有表達。apelin的前體肽源由77個氨基酸殘基組成，其羧基C末端

5、為合成肽序列，可被肽酶分解成多種相對分子量不同的成熟apelin活性肽，包括apelin-17、apelin-36、apelin-12、apelin-13等，其中apelin-13的生物活性可能最強。
　　Apelin/APJ系統(tǒng)在心臟方面的研究表明，apelin/APJ對缺血再灌注心肌具有保護作用:外源性apelin-13或apelin-36能夠減少心肌梗死體積;apelin-13能夠抑制缺血再灌注心肌細胞內質網依賴的凋亡;另外

6、，心肌缺血早期和缺血性心衰時內源性apelin/APJ表達增加，可以促使心肌細胞對抗缺血損傷、增加心肌收縮力。目前，apelin/APJ系統(tǒng)在腦血管病中的作用研究甚少，apelin對在體缺血再灌注后腦組織是否具有保護作用？Apelin作用的下游機制如何？這些問題還有待于進一步研究。本研究將分三部分對上述問題進行探討，現將各部分內容概述如下:
　　第一部分、Apelin對局灶性腦缺血再灌注小鼠的神經保護作用
　　目的:觀察ap

7、elin-13對腦缺血再灌注小鼠的作用。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠作為研究對象，采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血再灌注模型。將CD-1小鼠隨機分為6組:假手術組(Sham)、溶劑對照組(Vehicle)、缺血再灌注組(I/R)、apelin-13小劑量組(APLN-L)、apelin-13中劑量組(APLN-M)、apelin-13大劑量組(APLN-H)。
　　Sham組:除不插入尼龍魚線外其余操作同缺血再灌注組

8、。
　　Apelin干預組:在腦缺血后45 min，即再灌注前15 min，腦室注射5μl apelin-13。
　　Vehicle組:在腦缺血后45 min，即再灌注前15 min，腦室注射5μl2％ DMSO。
　　Apelin-13溶解于2％DMSO中，apelin-13小劑量為10μg/kg，中劑量為50μg/kg，大劑量為100μg/kg。腦缺血后24 h處死動物進行觀察、檢測。各組在取材前進行神經功能評分、

9、TTC染色評價腦梗死體積、干濕重法測定腦水腫、TUNEL染色觀察腦組織凋亡改變;并應用RT-qPCR和Western blotting方法檢測缺血腦組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA和蛋白水平的變化，酶組織化學法檢測cleaved caspase-3活性的變化。
　　結果:
　?、偕窠浌δ茉u分:I/R組明顯高于Sham組(P＜0.05); APLN-H組明顯低于Vehicle組(P＜0.05); APLN-

10、M組、APLN-L組與Vehicle組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　?、谀X組織TTC染色:Sham組為均勻一致的紅色;I/R組、Vehicle組出現大范圍蒼白色梗死區(qū)域;APLN-L組、APLN-M組、APLN-H組梗死體積比Vehicle組減小。
　?、勰X組織含水量:I/R組（84.68±0.929）％明顯高于Sham組(78.33±0.625)％(P＜0.05); APLN-H組(82.70±1.172)％、AP

11、LN-M組(83.70±1.048)％明顯低于Vehicle組（84.51±1.401）％（P＜0.05）;APLN-L（84.81±0.919）％組與Vehicle組（84.51±1.401）％差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　?、躎UNEL染色:光鏡(400×)觀察，Sham組腦組織切片未見明顯病理學改變，細胞形態(tài)完整，未見TUNEL陽性細胞;I/R組梗死周圍組織明顯水腫、壞死，可見許多深染、固縮核細胞;TUNEL陽性細胞

12、數:APLN-H組（28.00±2.280/每高倍視野）、APLN-M組（32.40±3.262/每高倍視野）明顯低于Vehicle組（42.80±3.544/每高倍視野）（P＜0.05）;APLN-L組（41.40±1.200/每高倍視野）與Vehicle組（42.80±3.544/每高倍視野）差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　⑤RT-qPCR結果顯示，各實驗組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA均表達;I/R

13、組Bax、Bcl-2、caspase-3表達明顯高于Sham組(P＜0.05);APLN-H組、APLN-M組、APLN-L組Bax、caspase-3表達明顯低于Vehicle組(P＜0.05);APLN-H組、APLN-M組Bcl-2明顯高于Vehicle組（P＜0.05）;APLN-L組與Vehicle組Bcl-2表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　⑥Western-blotting結果顯示，各實驗組均有Bax、Bc

14、l-2、caspase-3表達;I/R組Bax、Bcl-2、caspase-3表達明顯高于Sham組(P＜0.05);APLN-H組、APLN-M組、APLN-L組Bax、caspase-3表達明顯低于Vehicle組，Bcl-2表達明顯高于Vehicle組(P＜0.05)。
　　⑦Western-blotting結果顯示，各實驗組均有cleaved caspase-3表達;I/R組cleaved caspase-3表達明顯高于S

15、ham組(P＜0.05);APLN-H組、APLN-M組、APLN-L組cleaved caspase-3表達明顯低于Vehicle組(P＜0.05)。
　　⑧I/R組cleaved caspase-3活性明顯高于Sham組(P＜0.05);APLN-H組、APLN-M組、APLN-L組cleaved caspase-3活性明顯降于Vehicle組（P＜0.05)。
　　結論:局灶性腦缺血再灌注后，小鼠出現明顯的神經功能缺損

16、、腦水腫，apelin-13能夠改善神經功能缺損，減輕腦水腫并減少梗死體積，具有神經保護作用。局灶性腦缺血再灌注后，缺血周邊區(qū)腦組織細胞發(fā)生凋亡，出現大量TUNEL陽性細胞，apelin-13干預后TUNEL陽性細胞減少，抑制細胞凋亡。Apelin-13的抗凋亡作用是通過對凋亡相關因子Bax、Bcl-2、caspase-3的調節(jié)實現的，其可以下調促凋亡蛋白Bax、caspase-3表達，抑制caspase-3活性，同時上調抗凋亡蛋白Bc

17、l-2表達。由此證明，apelin-13對缺血再灌注后腦組織具有保護作用，抗凋亡是其作用靶點之一。
　　第二部分、ERK1/2信號通路與apelin-13抗凋亡作用相關性的研究
　　目的:研究apelin-13對腦缺血再灌注損傷保護作用的機制，探討ERK1/2信號通路是否參與apelin-13的抗凋亡機制。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對象，采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血再灌注模型。實驗1:采用隨機方法將

18、CD-1小鼠分為6組:假手術組(Sham)、缺血再灌注組(I/R)、溶劑對照組(Vehicle)、apelin-13小劑量組(APLN-L)、apelin-13中劑量組(APLN-M)、apelin-13大劑量組(APLN-H)。實驗2:采用隨機方法將CD-1小鼠分為5組:假手術組(Sham)、溶劑對照組(Vehicle)、apelin-13中劑量組(APLN-M)、apelin-13中劑量+PD98059組(APLN+PD)、PD98

19、059+缺血再灌注組(PD)。
　　Sham組:除不插入尼龍魚線外其余操作同缺血再灌注組。
　　Apelin-13干預組:實驗1中，在腦缺血后45 min，即再灌注前15 min，腦室注射5μl apelin-13。實驗2中，在腦缺血前15 min腦室注射5μl2％DMSO，在再灌注前15 min腦室注射5μl中劑量apelin-13。
　　Vehicle組:實驗1中，在腦缺血后45 min，即再灌注前15 min，腦

20、室注射5μl2％DMSO。實驗2中，分別在腦缺血前15 min、再灌注前15 min，腦室注射5μl2％DMSO。
　　PD98059干預組:實驗2中，APLN+PD組在腦缺血前15 min腦室注射5μl PD98059，在再灌注前15 min腦室注射5μl中劑量apelin-13。 PD組在腦缺血前15 min腦室注射5μl PD98059，在再灌注前15 min腦室注射5μl2％DMSO。
　　Apelin-13溶解于2

21、％DMSO中，apelin-13小劑量為10μg/kg，中劑量為50μg/kg，大劑量為100μg/kg。PD98059溶解于2％DMSO中，濃度為2 mmol/L。各組在術后24 h取材，分別用RT-qPCR和Western-blotting方法檢測缺血腦組織中ERK1/2、Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA和蛋白水平的變化，酶組織化學法檢測cleaved caspase-3活性改變。
　　結果:
　　實驗1

22、:
　　①RT-qPCR結果顯示，各實驗組ERK1/2 mRNA均表達，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　?、赪estem-blotting結果顯示，各實驗組均有ERK1/2蛋白表達，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各實驗組均有p-ERK1/2蛋白表達;I/R組p-ERK1/2表達明顯高于Sham組(P＜0.05);APLN-H組、APLN-M組、APLN-L組p-ERK1/2表達明顯高于Vehicle組(P＜0.05

23、)。
　　實驗2:Apelin-13聯(lián)合PD98059干預
　?、賀T-qPCR結果顯示，各實驗組均有ERK1/2 mRNA表達，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　?、赪estern-blotting結果顯示，各實驗組均有ERK1/2蛋白表達，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);PD組p-ERK1/2表達明顯低于Vehicle組(P＜0.05);APLN+PD組p-ERK1/2表達明顯低于APLN-M組(P＜0.05

24、)。
　?、跼T-qPCR結果顯示，各實驗組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA均表達，PD組與Vehicle組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); APLN-M組Bax、caspase-3 mRNA表達明顯低于Vehicle組，Bcl-2mRNA表達高于Vehicle組(P＜0.05);APLN+PD組Bax、caspase-3 mRNA表達明顯高于APLN-M組，B

25、cl-2 mRNA表達明顯低于APLN-M組(P＜0.05); APLN+PD組Bax、Bcl-2 mRNA表達與PD組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，caspase-3 mRNA表達明顯低于PD組(P＜0.05)。
　?、躓estern-blotting結果顯示，各實驗組均有Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達，PD組與Vehicle組Bax、Bcl-2、caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); AP

26、LN-M組Bax、caspase-3表達明顯低于Vehicle組，Bcl-2表達高于Vehicle組(P＜0.05); APLN+PD組Bax、caspase-3表達明顯高于APLN-M組，Bcl-2表達明顯低于APLN-M組(P＜0.05); APLN+PD組Bax、Bcl-2表達與PD組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，caspase-3表達明顯低于PD組(P＜0.05)。
　?、軼estern-blotting結果顯示，各實

27、驗組均有cleaved caspase-3蛋白表達;PD組與Vehicle組cleaved caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);APLN-M組cleaved caspase-3表達明顯低于Vehicle組(P＜0.05);APLN+PD組cleaved caspase-3表達明顯高于APLN-M組（P＜0.05）;APLN+PD組cleaved caspase-3表達與PD組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

28、　?、轆PLN-M組cleaved caspase-3活性明顯低于Vehicle組(P＜0.05);APLN+PD組cleaved caspase-3活性明顯高于APLN-M組(P＜0.05);APLN+PD組cleaved caspase-3活性明顯低于PD組(P＜0.05)。
　　結論:局灶性腦缺血再灌注后，腦組織p-ERK1/2蛋白表達增高，而ERK1/2總蛋白未發(fā)生明顯改變，提示ERK1/2蛋白的激活可能在缺血再灌注損傷病

29、理機制中發(fā)揮著重要作用。Apelin-13能使局灶性腦缺血再灌注后腦組織p-ERK1/2蛋白表達進一步增高，提示apelin-13能夠促進缺血腦組織ERK1/2蛋白的激活，同時提示ERK1/2信號通路可能參與了apelin-13的作用機制。應用PD98059抑制ERK1/2活化后，apelin-13對局灶性腦缺血再灌注腦組織凋亡相關因子Bax、Bcl-2、caspase-3的調節(jié)作用減弱或者消失，證明了apelin-13對Bax、Bcl

30、-2、caspase-3的調節(jié)作用與ERK1/2的活化相關，即ERK1/2信號通路參與了apelin-13的抗凋亡作用。
　　第三部分、PI-3K/Akt信號通路與apelin-13抗凋亡作用相關性的研究
　　目的:研究apelin-13對腦缺血再灌注損傷保護作用的機制，探討PI-3K/Akt信號通路是否參與apelin-13抗凋亡機制。
　　方法:選用成年雄性CD-1小鼠為研究對象，采用改良線栓法制備大腦中動脈缺血再

31、灌注模型。實驗1:采用隨機的方法將CD-1小鼠分為6組:假手術組(Sham)、缺血再灌注組（I瓜）、溶劑對照組(Vehicle)、apelin-13小劑量組(APLN-L)、apelin-13中劑量組(APLN-M)、apelin-13大劑量組(APLN-H)。實驗2:采用隨機的方法將CD-1小鼠分為5組:假手術組(Sham)、溶劑對照組(Vehicle)、apelin-13中劑量組(APLN-M)、apelin-13中劑量+LY294

32、002組(APLN+LY)、LY294002+缺血再灌注組(LY)。
　　Sham組:除不插入尼龍魚線外其余操作同缺血再灌注組。
　　Apelin-13干預組:實驗1中，在腦缺血后45 min，即再灌注前15 min，腦室注射5μl apelin-13。實驗2中，在腦缺血前15 min腦室注射5μl2％ DMSO;再灌注前15 min腦室注射5μl中劑量apelin-13。
　　Vehicle組:實驗1中，在腦缺血后4

33、5 min，即再灌注前15 min，腦室注射5山2％ DMSO。實驗2中，分別在腦缺血前15 min、再灌注前15min，腦室注射5μl2％DMSO。
　　LY294002干預組:實驗2中，APLN+LY組在腦缺血前15 min腦室注射5μl LY294002，在再灌注前15 min腦室注射5μl中劑量apelin-13。LY組在腦缺血前15min腦室注射5μl LY294002，在再灌注前15 min腦室注射5μl2％DMSO。

34、
　　Apelin-13溶解于2％DMSO中，apelin-13小劑量為10μg/kg，中劑量為50μg/kg，大劑量為100μg/kg。LY294002溶解于2％DMSO中，濃度為10 mmol/L。各組在術后24 h取材，分別用RT-qPCR和Western-blotting方法檢測缺血腦組織中Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA和蛋白水平的變化，酶組織化學法檢測cleaved caspase-3活性改變。

35、
　　結果:
　　實驗1:
　?、賀T-qPCR結果顯示，各實驗組均有Akt mRNA表達，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　?、赪estern-blotting結果顯示，各實驗組均有Akt蛋白表達，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各實驗組均有p-Akt蛋白表達;I/R組p-Akt表達明顯高于Sham組(P＜0.05); APLN-H組、APLN-M組、APLN-L組p-ERK1/2表達明顯高于Vehicl

36、e組(P＜0.05)。
　　實驗2:Apelin-13聯(lián)合PD98059干預
　?、賀T-qPCR結果顯示，各實驗組均有ERK1/2 mRNA表達，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　?、赪estern-blotting結果顯示，各實驗組均有Akt蛋白表達，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;LY組p-Akt表達明顯低于Vehicle組（P＜0.05）;APLN+LY組p-Akt表達明顯低于APLN-M組(P＜0.05

37、)。
　?、跼T-qPCR結果顯示，各實驗組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA均表達;LY組與Vehicle組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);APLN-M組Bax、caspase-3 mRNA表達明顯低于Vehicle組，Bcl-2mRNA表達明顯高于Vehicle組(P＜0.05);APLN+LY組Bax、caspase-3mRNA表達明顯高于APLN-M組，B

38、cl-2 mRNA表達明顯低于APLN-M組(P＜0.05); APLN+LY組Bax、Bcl-2 mRNA表達與LY組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，caspase-3 mRNA表達明顯低于LY組(P＜0.05)。
　?、躓estern-blotting結果顯示，各實驗組均有Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達;LY組與Vehicle組Bax、Bcl-2、caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); AP

39、LN-M組Bax、caspase-3表達明顯低于Vehicle組，Bcl-2表達明顯高于Vehicle組（P＜0.05）;APLN+LY組Bax、caspase-3表達明顯高于APLN-M組，Bcl-2表達明顯低于APLN-M組(P＜0.05);APLN+LY組Bcl-2表達與LY組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，Bax、caspase-3表達明顯低于LY組（P＜0.05）。
　?、軼estern-blotting結果顯示，各實

40、驗組均有cleaved caspase-3蛋白表達;LY組與Vehicle組cleaved caspase-3表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);APLN-M組cleaved caspase-3表達明顯低于Vehicle組(P＜0.05);APLN+LY組cleaved caspase-3表達明顯高于APLN-M組（P＜0.05）;APLN+LY組cleaved caspase-3表達明顯低于LY組(P＜0.05)。
　?、轆P

41、LN-M組cleaved caspase-3活性明顯低于Vehicle組（P＜0.05）;APLN+LY組cleaved caspase-3活性明顯高于APLN-M組(P＜0.05);APLN+LY組cleaved caspase-3活性明顯低于LY組(P＜0.05)。
　　結論:局灶性腦缺血再灌注后，腦組織p-Akt表達增高，提示Akt蛋白的激活可能在缺血再灌注損傷病理機制中發(fā)揮著重要作用。Apelin-13干預使局灶性腦缺血再

42、灌注后腦組織p-Akt表達進一步增高，提示apelin-13能夠促進缺血腦組織Akt蛋白的激活，Akt信號通路可能參與了apelin-13的作用機制。應用LY294002抑制Akt活化后，apelin-13對局灶性腦缺血再灌注后腦組織凋亡相關因子Bax、Bcl-2、caspase-3的調節(jié)作用減弱或者消失，證明了apelin-13對Bax、Bcl-2、caspase-3的調節(jié)作用與Akt的活化相關，即Akt信號通路參與了apelin-1