腦缺血-再灌注期MAPK-ERK信號(hào)通路與PI3K-AKT信號(hào)通路的相互作用.pdf

1、目的：
　　有絲分裂活化蛋白激酶(MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)分子信號(hào)通路是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)下游的主要分子信號(hào)通路之一，其激活過(guò)程如下：細(xì)胞膜表面的EGFR直接或間接激活，激活的EGFR通過(guò)一定途徑將胞質(zhì)中的生長(zhǎng)因子受體綁定蛋白(Grb)2，Src同源和膠原蛋白(Shc)，SOS1(Sonof Sevenless)蛋白，激活下游的小G蛋白R(shí)as磷酸化激活下游的Raf, Raf進(jìn)一步激活MEK，最后激活ERK

2、。
　　PI3K/AKT信號(hào)通路是EGFR下游的另一條重要的信號(hào)分子通路，EGFR磷酸化激活后招募shc，Grb2，SOS1至細(xì)胞膜，形成Shc-Grb2-SOS1復(fù)合物，復(fù)合物可招募并激活小G蛋白R(shí)as，Ras可激活p110 PI3K從而激活PI3K。激活的PI3K可將3，4，或4，5-二磷脂酰肌醇(PIP2)催化成為3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3可以招募并激活PDK1， PDK1可進(jìn)一步磷酸化Akt的T30

3、8及S473，從而激活A(yù)kt。
　　眾多研究發(fā)現(xiàn)EGFR間接激活，MAPK/ERK信號(hào)通路，PI3K/AKT信號(hào)通路在缺血/再灌注時(shí)過(guò)程中具有作用。如心肌細(xì)胞缺血預(yù)處理通過(guò)EGFR間接激活發(fā)揮心肌保護(hù)作用。EGFR間接激活還在再灌注引起的心率失常中發(fā)揮作用。以新生的小豬為研究對(duì)象，大腦皮層在低氧情況下可以導(dǎo)致NO依賴性的EGFR磷酸化和激活增加。以大鼠大腦中動(dòng)脈模型為研究對(duì)象，結(jié)果顯示在短暫性缺血1hr后皮質(zhì)邊緣區(qū)的EGFR磷酸化

4、在再灌注3，7，14天均有顯著性提高。有研究發(fā)現(xiàn)在MCAO模型中使用EGFR抑制劑C225可明顯減少缺血灶范圍，減少反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞增生。研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路主要發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的作用，然而MAPK/ERK信號(hào)通路的作用更為復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)短暫的，不劇烈的ERK磷酸化升高具有細(xì)胞保護(hù)作用，如缺血預(yù)處理中ERK磷酸化的改變及其發(fā)揮的作用。與之相反，持續(xù)性的ERK磷酸化可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
　　EGFR是受體酪氨酸激酶（RTKs

5、）家族中的一員，其結(jié)構(gòu)主要由三部分構(gòu)成，細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)域，單跨膜區(qū)域，胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域。當(dāng)EGF家族成員與EGFR結(jié)合后，EGFR形成同源或異源二聚體，EGFR二聚體的胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域特定位點(diǎn)具有自身固有的酪氨酸激酶活性，從而使得EGFR發(fā)生自身磷酸化。EGFR的胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域中存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，EGFR上的這些磷酸化位點(diǎn)與作為連接位點(diǎn)與多種蛋白結(jié)合，由于磷酸化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)差異，磷酸化位點(diǎn)與蛋白的親和力也有所差別，從而導(dǎo)致磷

6、酸化位點(diǎn)與特定的蛋白結(jié)合，激活和調(diào)節(jié)下游特定的分子信號(hào)通路。不同刺激可導(dǎo)致EGFR上不同位點(diǎn)磷酸化水平改變，從而導(dǎo)致下游信號(hào)通路活化水平的改變。
　　Raf-1由3個(gè)保守區(qū)域(CR)構(gòu)成。其中CR1為結(jié)合區(qū)，包含1個(gè)Ras結(jié)合區(qū)域（RBD）和1個(gè)半胱氨酸富集區(qū)域(CRD)，RBD與Ras及細(xì)胞膜的磷脂結(jié)合，使得Raf-1可以被招募到細(xì)胞膜上，Ras與Raf-1的CR2是參與負(fù)性調(diào)節(jié)Raf-1活性及Ras-Raf-1結(jié)合的磷酸化位點(diǎn)

7、，CR3是功能區(qū)，區(qū)域中氨基酸位點(diǎn)的激活使得Raf-1具有蛋白激酶活性。研究對(duì)Raf-1活性調(diào)節(jié)的具體機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Raf-1的338位絲氨酸和341位酪氨酸磷酸化是Raf-1激活所必須的，其中Ser338由Ras或生長(zhǎng)因子激活。Raf-1的激活也能通過(guò)Raf-1上其他氨基酸位點(diǎn)的磷酸化進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。Ser259是抑制Raf-1活性的主要位點(diǎn)，AKT通過(guò)磷酸化Raf-1的Ser259來(lái)抑制Raf-1活性。
　　MAPK/E

8、RK信號(hào)通路與PI3K/AKT信號(hào)通路是EGFR之后的重要的下游信號(hào)通路，早期研究認(rèn)為這兩條通路相互獨(dú)立，之后越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)在多種條件下這兩條通路之間存在相互作用(Crosstalk)，而這些Crosstalk在調(diào)節(jié)這兩條通路的激活上發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響有正性影響和負(fù)性影響，
　　PI3K/AKT信號(hào)通路主要通過(guò)影響Ras，Raf-1來(lái)影響MAPK/ERK信號(hào)通路。

9、PI3K/Akt通路對(duì)Ras/ERK通路的調(diào)節(jié)機(jī)制之一為PIP3對(duì)RasGEF及RasGAP的調(diào)節(jié)，活化的AKT直接磷酸化Raf的負(fù)性調(diào)節(jié)位點(diǎn)Ser259來(lái)降低Raf活性。此外，PI3K可激活Rac/Cdc42/PAK通路，PAK可磷酸化Raf的正性功能調(diào)節(jié)位點(diǎn)Ser338來(lái)上調(diào)Raf活性，從而提高下游的ERK磷酸化。
　　方法：
　　采用大鼠大腦中動(dòng)脈模型。①在MCAO模型缺血前分別側(cè)腦室注射選擇性PI3K抑制劑LY294

10、002，AKT抑制劑Triciribine，EGFR抑制劑AG1478，MMP抑制劑GM6001，MEK抑制劑U0126，用免疫印跡方法檢測(cè)腦組織EGFR，ERK，AKT磷酸化水平，EGFR酪氨酸位點(diǎn)磷酸化情況，Raf的Ser259及Ser338磷酸化情況，用免疫共沉淀方法檢測(cè)SOS1與EGFR的連接情況，Raf-1與pAKT的連接情況;②在MCAO模型再灌注前側(cè)腦室注射EGFR抑制劑AG1478，MMP抑制劑GM6001，MEK抑制劑

11、U0126，ROS抑制劑Catalase，用免疫印跡方法檢測(cè)腦組織EGFR，ERK，AKT磷酸化水平，EGFR酪氨酸位點(diǎn)磷酸化情況。
　　使用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組資料用one-way ANOVA方法進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.腦缺血期腦內(nèi)ERK1/2，AKT, EGFR的激活
　　檢測(cè)大鼠腦缺血后2小時(shí)，腦組織ERK1/2，AKT的磷酸化情況。結(jié)果顯示，

12、缺血時(shí)ERK1/2磷酸化水平無(wú)明顯改變，AKT磷酸化水平明顯升高。在腦缺血前側(cè)腦室注射抑制劑AG1478，GM6001，其中AG1478是EGFR的抑制劑，GM6001是鋅離子依賴性金屬蛋白酶的抑制劑可明顯降低AKT磷酸化水平。
　　缺血時(shí)EGFR的Y845，Y1173，Y1045磷酸化明顯升高，其中Y845磷酸化水平增加程度最大，是Contralateral hemisphere的400％。結(jié)果顯示Ischaemia及Contr

13、alateral hemisphere的Y992，Y1068均無(wú)磷酸化。
　　2.腦缺血期SOS1及Raf-1的功能
　　缺血時(shí)SOS1與EGFR的結(jié)合程度明顯升高。缺血時(shí)Raf-1 Ser259磷酸化明顯升高，Raf-1 Ser338磷酸化無(wú)改變。
　　3.腦缺血期PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)Raf-1的影響
　　缺血時(shí)Raf-1與p-AKT的結(jié)合程度明顯升高。缺血前側(cè)腦室分別注射PI3K抑制劑LY294002，

14、AKT抑制劑TCN，可明顯降低缺血時(shí)的AKT磷酸化程度。
　　討論：
　　首先，本研究發(fā)現(xiàn)缺血期ERK1/2磷酸化與非缺血期相比無(wú)明顯改變，而再灌注期ERK1/2磷酸化明顯升高。缺血期AKT磷酸化明顯升高，而且這種AKT磷酸化的升高可以被EGFR抑制劑AG1478及金屬蛋白酶GM6001所抑制，說(shuō)明缺血期AKT磷酸化的升高與EGFR間接激活相關(guān)，而不是EGFR的直接激活。缺血期EGFR磷酸化明顯升高，使用EGFR磷酸化位點(diǎn)抗

15、體對(duì)EGFR磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示缺血期EGFR的磷酸化位點(diǎn)是Y1173，Y845，Y1045。Y992，Y1173，Y1045是主要的自身磷酸化位點(diǎn)，其中以Y1173磷酸化為主，Y992磷酸化最低。Y845則是主要的Src磷酸化位點(diǎn)。EGFR磷酸化位點(diǎn)的磷酸化情況與細(xì)胞種類相關(guān)，有研究顯示腦中和星型膠質(zhì)細(xì)胞的EGFR的Y1068并不發(fā)生磷酸化，除非使用EGF和氨刺激。
　　其次，本研究發(fā)現(xiàn)雖然缺血期ERK1/2無(wú)明顯磷酸化

16、，但在EGFR/Ras/Raf/MEK/ERK通路中SOS1與Ras的相互作用與非缺血期相同。缺血期Raf-1的活化磷酸化位點(diǎn)Ser338的磷酸化與非缺血期無(wú)明顯差異，而缺血期Raf-1的活性抑制磷酸化位點(diǎn)Ser259的磷酸化升高。這一結(jié)果說(shuō)明缺血期ERK1/2無(wú)明顯磷酸化是因?yàn)镋GFR/Ras/Raf/MEK/ERK通路中的Raf-1的活性受抑制。缺血期的Raf-1與p-AKT的鏈接增強(qiáng)。為了驗(yàn)證缺血期PI3K/AKT通路對(duì)Raf/M

17、APK/ERK通路的抑制作用，我們?cè)谌毖谇皞?cè)腦室注射PI3K抑制劑 LY294002及AKT抑制劑TCN，結(jié)果顯示LY294002和TCN均能升高缺血期ERK1/2的磷酸化水平。提示缺血期PI3K/AKT信號(hào)通路抑制Raf/MAPK/ERK1/2信號(hào)通路。
　　結(jié)論：
　　腦缺血/再灌注期Raf/MAPK/ERK1/2信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路之間存在抑制性相互作用。腦缺血期PI3K/AKT信號(hào)通路通過(guò)磷酸Raf-