實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測肉中沙門氏菌的研究.pdf

1、由沙門氏菌引起的食源性疾病在公共衛(wèi)生學(xué)上是一種具有重要意義的人畜共患病之一。每年至少有50％的食源性疾病是由沙門氏菌引起的，而檢測沙門氏菌的方法通常是耗時長，特異性，靈敏度不高，這已經(jīng)不適應(yīng)時代的發(fā)展了，在飛速發(fā)展的今天迫切需要建立一種耗時短，高靈敏度，高特異性的檢驗沙門氏菌的方法。
　　 實時熒光LAMP法是在環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)的基礎(chǔ)上建立的

2、一種新穎的核酸體外擴增技術(shù)，是在LAMP反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號來實時監(jiān)控LAMP反應(yīng)的進(jìn)程。已經(jīng)應(yīng)用于檢測病原菌等諸多領(lǐng)域。該方法具有操作簡單、耗時短、實時監(jiān)控等優(yōu)點。
　　 本文針對沙門氏菌(Salmonella)保守的invA基因設(shè)計了一對特異性強的引物，本研究通過優(yōu)化體系中Mg2+、dNTPs、Bet、Bst鏈置換聚合酶、模板的添加量以及體系的反應(yīng)溫度還有內(nèi)外引物濃度比來確定適宜的擴增的體系和程序。已確定的反

3、應(yīng)體系是:2.5μL10×Bstbuffer,鎂離子(50mM)添加量為1μL，5μLdNTPs(2.5mM)混合物，Bst酶(8000U/ml)1μL，1μL甜菜堿(5M)，模板DNA1.5μL，SYBR0.5μL，F(xiàn)IP和BIP引物(10mM)各2.5μL，F(xiàn)3和B3引物(10mM)各0.5μL，雙蒸水6.5μL，總反應(yīng)體系25μL，61℃反應(yīng)1h。
　　 本研究為驗證實時熒光LAMP引物的特異性選取了常見致病菌分別進(jìn)行反應(yīng)

4、，結(jié)果表明:沙門氏菌顯示陽性，而其它非沙門氏菌菌株均顯示陰性。
　　 本研究比較了實時熒光LAMP方法與PCR方法檢測純菌的靈敏度，人工污染肉制品的檢出限，結(jié)果表明:實時熒光LAMP檢測沙門氏菌的靈敏度達(dá)到5.6×101CFU/mL。PCR檢測沙門氏菌的靈敏度為5.6×102CFU/mL。實時熒光LAMP法和PCR法檢測人工污染肉中沙門氏菌的檢出限分別為5.6×104CFU/mL和5.6×105CFU/mL。
　　 本研