13-甲基十四烷酸誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株T24凋亡及其機(jī)理研究.pdf

1、本文擬通過(guò)體外培養(yǎng)膀胱癌T24細(xì)胞株，研究13-MTD對(duì)T24細(xì)胞株增殖和凋亡的影響，探討其應(yīng)用于膀胱癌預(yù)防和治療的可能性。通過(guò)對(duì)常見(jiàn)凋亡相關(guān)性蛋白的研究探討13-MTD促進(jìn)T24細(xì)胞株凋亡的信號(hào)通路，為13-MTD的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法：首先通過(guò)MTT法檢測(cè)13-MTD對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24凋亡的生長(zhǎng)抑制，通過(guò)TUNEL末端標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、western檢測(cè)凋亡蛋白等方法研究13-MTD

2、是否引起膀胱癌細(xì)胞株T24凋亡，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)westernblot方法研究13-MTD是通過(guò)Fas受體途徑還是通過(guò)線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C途徑引起細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步通過(guò)westernblot方法研究MAPK、AKT等信號(hào)途徑在13-MTD誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株T24凋亡中的作用。 1.細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組膀胱癌T24細(xì)胞株用含10％新生牛血清的Mccoy’5A培養(yǎng)基，置于5％CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)分藥物處理組和

3、溶劑對(duì)照組兩個(gè)大組，分別在處理后2、8、12、24、48小時(shí)收集細(xì)胞。 2.MTT法檢測(cè)13-MTD對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響以1×104/孔接種細(xì)胞至96孔板，24小時(shí)后換含藥物的新鮮培養(yǎng)基。處理12、24小時(shí)后加MTT孵育4小時(shí)，酶標(biāo)儀上檢測(cè)光密度，計(jì)算細(xì)胞活力。 3.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期各組細(xì)胞以70％冰乙醇，固定過(guò)夜，然后以RNA酶處理和PI染料染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 4.細(xì)胞凋亡TUNEL(D

4、NA切口末端標(biāo)記法)分析取處理后的各組細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定后，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(InSituCellDeathDetectionKit)說(shuō)明進(jìn)行操作。DAB顯色后計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞百分比。 5.蛋白免疫印跡法分析參與凋亡的蛋白將各組細(xì)胞裂解提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后用可能參與細(xì)胞凋亡的各種蛋白的抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，ECL化學(xué)發(fā)光，曝光后進(jìn)行圖像分析。 研究結(jié)果

5、： 1.MTT法檢測(cè)不同藥物濃度的13-MTD對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與對(duì)照組相比，13-MTD對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞株增殖抑制作用明顯，其中35ug/ml～140ug/ml的藥物濃度在12小時(shí)和24小時(shí)后均可抑制細(xì)胞增殖(P＜0.05)。相對(duì)抑制率(IR)表明13-MTD的抑制作用有時(shí)間濃度依賴(lài)效應(yīng)。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率13-MTD處理細(xì)胞2、8、24、48小時(shí)后，隨著藥物作用時(shí)間的增加，亞二倍體峰細(xì)胞數(shù)量顯

6、著增加(P＜0.05)，48小時(shí)后細(xì)胞的凋亡率可以達(dá)到84％，但不同時(shí)間的細(xì)胞G0-G1，S期，G2/M期的DNA百分比沒(méi)有明顯的差別。 3.TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)TUNEL法檢測(cè)結(jié)果經(jīng)定量分析證實(shí)細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=10，P=0.01)，采用LSD-t法進(jìn)行藥物組和溶劑組組間比較結(jié)果顯示：藥物處理12小時(shí)較溶劑組相比較差異有顯著性[(43.2±4.6)％，(4.5±0.28)％，P＜0.01]，24小時(shí)差異更

7、加明顯[(68.2±3.8)％，(6.3±0.35)％，P＜0.01]。 4.westernblotting檢測(cè)參與13-MTD誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的蛋白和信號(hào)通路藥物處理后細(xì)胞內(nèi)bcl-2蛋白量降低，bax含量升高，線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C釋放，caspase酶底物PARP、LaminB、RB在12小時(shí)出現(xiàn)明顯的裂解片段，2小時(shí)后P38和JNK磷酸化開(kāi)始升高，AKT磷酸化下降，F(xiàn)ADD及磷酸化FADD沒(méi)有明顯變化，c-myc、P

8、21沒(méi)有變化。 研究結(jié)論： 1.13-MTD可以誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞凋亡，并且具有時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性。 2.13-MTD能夠調(diào)節(jié)Bcl-2超家族中的Bcl-2蛋白和bax蛋白含量，激活線(xiàn)粒體凋亡途徑，使線(xiàn)粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放到胞漿，激活Caspase酶，裂解相應(yīng)的凋亡底物L(fēng)aminB、Rb、PARP，促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡。 3.在13-MTD誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株T24細(xì)胞凋亡的過(guò)程中P38MAPK信