LRIG1抑制EGFR入核增強(qiáng)順鉑對T24膀胱癌細(xì)胞損傷的研究.pdf

1、背景及目的:膀胱腫瘤患者近70％為表淺性，即非肌層浸潤性，多數(shù)患者能通過經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)等局部治療手段控制病情。余下的20-30％常伴有膀胱肌層侵犯，其中晚期患者常需要聯(lián)合全身化療才能控制病情，提高患者的生存率。順鉑是治療晚期侵襲性膀胱腫瘤的常用化療藥物，屬于引起DNA損傷的藥物之一。盡管順鉑有一定的療效，但由于藥物部分或完全耐受，僅有15％的晚期膀胱癌患者獲得完全緩解。最近的研究表明，多種引起DNA損傷的治療能導(dǎo)致表皮生長因子受體

2、（EGFR）入核，并引起DNA的損傷修復(fù)。因此，抑制EGFR 入核可能起到增強(qiáng)順鉑DNA損傷的能力，從而提高順鉑的療效。目前，抑制EGFR 入核的方法主要有抑制EGFR的激活以及抑制EGFR 酪氨酸激酶的活性兩種途徑。但目前尚無對抑制EGFR 入核誘導(dǎo)增強(qiáng)順鉑對膀胱腫瘤療效方面的研究。富含亮氨酸重復(fù)序列及免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1（LRIG1）是EGFR的天然配體之一。其在膀胱腫瘤組織中表達(dá)缺失或者完全不表達(dá)。前期研究發(fā)現(xiàn)，在表淺性膀胱癌細(xì)胞

3、系BIU-87中上調(diào)LRIG1的表達(dá)水平能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲的能力。上述研究結(jié)果使假設(shè)，是否能通過LRIG1 抑制EGFR的活性，影響pEGFR的入核水平，增敏順鉑的療效。
　　 設(shè)計(jì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟冢ㄟ^順鉑作用膀胱癌細(xì)胞系T24，研究其是否能導(dǎo)致DNA損傷后EGFR入核。在聯(lián)合LRIG1轉(zhuǎn)染后，觀察pEGFR入核是否能受到抑制，LRIG1是否能藉此增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)DNA損傷的能力。
　　 方法:

4、采用順鉑分別處理T24膀胱腫瘤細(xì)胞10，20和30分鐘，提取各組蛋白的核蛋白及總蛋白。免疫印跡法檢測細(xì)胞核蛋白內(nèi)pEGFR的水平和總蛋白中EGFR的水平。而后采用腺病毒載體包裝LRIG1基因轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，并采用順鉑處理30分鐘后再次檢測pEGFR和EGFR表達(dá)水平，觀察LRIG1是否能抑制順鉑誘導(dǎo)的EGFR入核。另外為了研究這種現(xiàn)象的機(jī)制，我們采用蛋白酶體抑制劑MG132預(yù)處理T24細(xì)胞后再轉(zhuǎn)染LRIG1，目的在于觀察LRIG1是否通

5、過EGFR-蛋白酶體通路影響EGFR以及pEGFR的表達(dá)水平。
　　 最后，分別采用單細(xì)胞凝膠電泳檢測腫瘤細(xì)胞DNA損傷程度，熒光流式細(xì)胞分選術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞周期以及細(xì)胞早期及晚期凋亡水平，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測腫瘤細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)水平，Transwell小室法檢測腫瘤細(xì)胞的侵襲能力等。目的在于，觀察LRIG1抑制EGFR入核后，順鉑對DNA的損傷能力是否增強(qiáng)。
　　 結(jié)果:在經(jīng)過順鉑誘導(dǎo)10，20和30分

6、鐘后，T24膀胱腫瘤細(xì)胞核內(nèi)的pEGFR表達(dá)水平明顯升高，但EGFR的整體表達(dá)水平無顯著變化。腺病毒載體成功包裝LRIG1基因后，將其轉(zhuǎn)染T24膀胱腫瘤細(xì)胞，再使用順鉑處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞及對照組細(xì)胞，檢測其核內(nèi)pEGFR表達(dá)水平及EGFR總量，觀察LRIG1是否能抑制EGFR入核。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了LRIG1后，核內(nèi)pEGFR的表達(dá)水平顯著下降，此外，EGFR的表達(dá)水平也顯著降低。此后，我們采用蛋白酶體抑制劑MG132，抑制在EGFR降解

7、過程中的關(guān)鍵酶體26S，觀察LRIG1是否通過降解EGFR抑制pEGFR入核?？梢奙G132處理后，LRIG1不能抑制EGFR降解，同時(shí)核內(nèi)pEGFR的水平也維持在較高的水平。在LRIG1聯(lián)合順鉑處理T24細(xì)胞后，我們發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中腫瘤細(xì)胞的OTM值顯著升高；細(xì)胞周期被抑制在S期；細(xì)胞早期和晚期的凋亡水平明顯升高；細(xì)胞PCNA的染色比例升高，但細(xì)胞增殖能力下降；細(xì)胞穿過Transwell小室的個(gè)數(shù)明顯減少，侵襲能力降低。