基于同軸電紡技術(shù)的rFN-CDH仿生支架體外促M(fèi)SC成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷或先天性原因?qū)е碌牟豢苫謴?fù)的骨組織損傷及結(jié)構(gòu)改變，每年有大量的患者需要通過(guò)骨移植方式進(jìn)行骨組織再生重建。當(dāng)前，很多種方法被應(yīng)用于骨組織修復(fù)重建，主要是通過(guò)使用自體骨移植（從患者），異體骨移植（從供體）和各種生物材料三種方式進(jìn)行。自體骨移植一直以來(lái)被認(rèn)為是治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然有成功的案例，但這種技術(shù)受到材料可用性的限制。同種異體植骨技術(shù)，則可能會(huì)引入免疫排斥反應(yīng)或病原體侵入等副作用。因此尋找可替代的人工骨修復(fù)材料成為骨組織修復(fù)

2、重建的發(fā)展方向。
　　成功實(shí)現(xiàn)組織工程化骨損傷修復(fù)包含三個(gè)主要因素:具有成骨分化潛能的種子細(xì)胞、具有誘導(dǎo)種子細(xì)胞向成骨方向分化的生長(zhǎng)因子以及支持種子細(xì)胞生長(zhǎng)的三維立體支架。因此，本課題的目的在于利用同軸靜電紡絲技術(shù)，構(gòu)建能夠緩慢釋放促成骨誘導(dǎo)因子的納米纖維復(fù)合支架。為種子細(xì)胞提供理想的體外增殖、粘附、分化微環(huán)境，促進(jìn)體外組織工程化骨損傷修復(fù)。為組織工程化骨損傷修復(fù)的研究提供新的思路。
　　方法:
　　1.不同rFN/C

3、DH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的制備
　　基于課題組的前期工作，課題組成員張瑗博士合成的rFN/CDH11蛋白的融合基因，利用pET22b作為基因載體，以Rosetta-gamiTM i(DE3)為感受態(tài)細(xì)胞，表達(dá)和純化得到的rFN/CDH11蛋白質(zhì)。采用同軸靜電紡絲技術(shù)，構(gòu)建含有聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、Ⅰ型膠原蛋白，以及不同濃度的重組纖維連接蛋白/鈣粘附蛋白(0μg/ml、1.0μg/ml、10

4、.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml)的仿生納米骨支架。
　　2.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的表征評(píng)價(jià)
　　利用傅立葉紅外光譜儀(FTIR)、X線光電子能譜(XPS)、掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)以及高效液相色譜分析(HPLC)等方法，了解骨支架的化學(xué)元素的組成、表面微觀結(jié)構(gòu)，納米纖維的微觀結(jié)構(gòu)以及rFN/CDH11蛋白的釋放效率;接觸角分析(Contact Angle)與生

5、物力學(xué)分析法用于測(cè)定納米骨支架的親/疏水性與抗拉強(qiáng)度、彈性模量。通過(guò)評(píng)價(jià)仿生骨納米支架的生物理化性質(zhì)，判斷能否與組織相容。
　　3.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的體外功能學(xué)研究
　　以入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)為種子細(xì)胞，通過(guò)掃描電鏡法觀察hMSCs在骨支架表面增殖、粘附、形態(tài)的情況;MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖與支架的對(duì)細(xì)胞的毒性作用;實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)ALPL基因、OCN基因、RUNX

6、2基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的制備
　　按照最適宜的同軸電紡參數(shù)條件（V=16-18Kv，v內(nèi)=v外=0.4-0.7ml/h，d=15cm），成功制備不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架若干張。
　　2.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的表征評(píng)價(jià)
　　(1)SEM觀察骨支架表面形態(tài)均勻，納米纖維連續(xù)性較好，無(wú)串珠樣纖維存在，直

7、徑分布均勻。Image J軟件測(cè)量結(jié)果顯示骨支架的纖維直徑與加入的rFN/CDH11蛋白成反比。(2)TEM觀察了單根同軸納米纖維的內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)，為具有相同軸心的殼-核結(jié)構(gòu)。(3)XPS數(shù)據(jù)顯示133.0 eV、164.0eV、190.0 eV以及401.0eV峰譜，即硫(S)、磷(P)、氮元素(N)，說(shuō)明Ⅰ型膠原蛋白與rFN/CDH11蛋白已經(jīng)被紡入同軸纖維內(nèi)。(4)FTIR結(jié)果表明，同軸電紡過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生新的化學(xué)基團(tuán)產(chǎn)生，同軸纖維具

8、各材料的優(yōu)勢(shì)性能。(5)孔隙率測(cè)定表明骨支架中的孔隙率介于67-76％之間，其大小與rFN/CDH11蛋白濃度成正比。(6)接觸角測(cè)試說(shuō)明骨支架中含rFN/CDH11蛋白濃度越大，支架的親水性越好。(7)力學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示骨支架的承受的抗拉強(qiáng)度及彈性模量與支架中的rFN/CDH11蛋白濃度成正比。(8)蛋白釋放檢測(cè)顯示出蛋白質(zhì)早期的“爆發(fā)性釋放”及后續(xù)的緩釋效果，實(shí)現(xiàn)了蛋白的可控緩慢釋放。通過(guò)以上表征評(píng)價(jià)，50μg/ml及100μg/ml

9、濃度的rFN/CDH11蛋白骨支架具有較好的理化性質(zhì)。
　　3.不同rFN/CDH11蛋白濃度的仿生納米骨支架的體外功能學(xué)研究
　　(1)SEM觀察hMSCs在接種到支架上培養(yǎng)3天、7天后的細(xì)胞形態(tài):3天組中50μg/ml蛋白濃度組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好，成嵌入式生長(zhǎng)在支架表面，粘稠物質(zhì)可能是分泌型成骨細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)。7天組，各個(gè)蛋白濃度組之間未見(jiàn)明顯差異(2) MTT法檢測(cè)支架的促細(xì)胞粘附作用:hMSCs細(xì)胞接種0.5h

10、，1h，2h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，50μg/ml蛋白濃度組的OD值均最大且明顯高于陰性對(duì)照組(p＜0.05)。(3) MTT法檢測(cè)骨支架促細(xì)胞增殖作用:hMSCs細(xì)胞接種2、4、6、8天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，50μg/ml蛋白濃度組的OD值均最大且明顯高于陰性對(duì)照組(p＜0.05)。(4)實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)試誘導(dǎo)成骨標(biāo)志基因的結(jié)果顯示:hMSCs細(xì)胞接種1、2、3周內(nèi)，50μg/ml蛋白濃度組與陰性對(duì)照組的RQ值倍數(shù)均最大且明顯高于陰性對(duì)照組(p＜0.

11、05);1周時(shí)，RUNX2基因表達(dá)最高，ALPL基因次之;2周時(shí)，OCN基因及ALPL基因表達(dá)升高，RUNX2基因表達(dá)相對(duì)下降;3周時(shí)RUNX2基因表達(dá)再次升高。通過(guò)以上細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，50μg/ml蛋白濃度的rFN/CDH11蛋白骨支架具有最佳的促hMSCs粘附、增殖、分化的作用。
　　結(jié)論:
　　1.本課題組前期工作中發(fā)現(xiàn)rFN/CDH11融合蛋白具有良好的促hMSCs細(xì)胞粘附、增殖及向成骨細(xì)胞方向分化的能力，結(jié)合同軸靜

12、電紡絲特有的殼-核結(jié)構(gòu)，較好的實(shí)現(xiàn)了rFN/CDH11蛋白的緩釋作用，持續(xù)而緩慢的作用于種子細(xì)胞。
　　2.同軸靜電紡絲法構(gòu)建的含有rFN/CDH11蛋白的納米纖維骨支架是由獨(dú)特的殼-核結(jié)構(gòu)，直徑分布為400-800nm的纖維通過(guò)無(wú)序的排列形成，微觀結(jié)構(gòu)類似于細(xì)胞外基質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。
　　3.同軸靜電紡絲法構(gòu)建的含有rFN/CDH11蛋白的納米纖維骨支架具有良好的親水性、抗拉強(qiáng)度、化學(xué)組成以及優(yōu)良的可降解性，是一種能與細(xì)胞相容

13、的仿生骨組織工程支架。
　　4.不同rFN/CDH11蛋白濃度的同軸靜電紡絲法構(gòu)建的納米纖維骨支架均促進(jìn)了hMSCs體外增殖、粘附作用，hMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，成骨標(biāo)志物基因如ALPL基因、OCN基因、RUNX2基因的表達(dá)上調(diào)。其中50μg/ml rFN/CDH11蛋白濃度的骨支架較其他4個(gè)濃度的納米纖維骨支架而言，成骨標(biāo)志基因表達(dá)顯著上調(diào)。
　　5.50μg/ml rFN/CDH11蛋白濃度的同軸靜電紡絲納米纖維骨支架