維甲酸-miR-16-CDC25B通路對(duì)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)制的研究.pdf

1、目的：檢測(cè) CDC25B在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)；構(gòu)建 shRNA-CDC25B慢病毒表達(dá)載體，沉默骨髓瘤細(xì)胞株 CDC25B基因的表達(dá)，探究 CDC25B基因沉默后對(duì)骨髓瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；利用生物信息學(xué)反向預(yù)測(cè)調(diào)控 CDC25B的miRNA，構(gòu)建該miRNA高表達(dá)的慢病毒載體以靶向抑制CDC25B基因的表達(dá)，由此通過穩(wěn)定干擾CDC25B基因的骨髓瘤細(xì)胞株觀察miRNA抑制CDC25B基因后對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)；研究全反式維甲酸

2、對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及其作用其機(jī)制。
　　方法：（1）利用基因芯片和Western Blot檢測(cè)CDC25B在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)。（2）利用real-time PCR和western blot檢測(cè)CDC25B在骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226和U266中的表達(dá)。設(shè)計(jì)合成以CDC25B為靶標(biāo)的shRNA，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體—GV248-shRNA，并以空載體做對(duì)照。由上海吉?jiǎng)P公司包裝出高滴度的慢病毒顆粒，感染 CDC25

3、B表達(dá)明顯上調(diào)的骨髓瘤細(xì)胞株，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選獲得穩(wěn)定株；利用 CCK8檢測(cè) shRNA干擾 CDC25B后骨髓瘤細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)干擾后骨髓瘤細(xì)胞周期和凋亡的變化、Hoechst33258熒光染色法觀察干擾后細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化。（3）利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè) miR-16對(duì) CDC25B表達(dá)的影響。（4）利用 real-time PCR檢測(cè) miR-16在骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226和U266中的表達(dá)；設(shè)計(jì)合成 miR

4、-16序列，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體—GV217- miR-16，以空載體做對(duì)照，由上海吉?jiǎng)P公司包裝出高滴度慢病毒顆粒，感染 miR-16表達(dá)明顯下調(diào)的骨髓瘤細(xì)胞株，再經(jīng)流式細(xì)胞儀分選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株；real-time PCR檢測(cè) miR-16及 CDC25B mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)CDC25B蛋白表達(dá)，CCK8檢測(cè)過表達(dá) miR-16的骨髓瘤細(xì)胞增殖，F(xiàn)CM檢測(cè)過表達(dá) miR-16骨髓瘤細(xì)胞周期和凋亡的變化。（5）不同濃

5、度全反式維甲酸（ATRA）作用于骨髓瘤細(xì)胞后，應(yīng)用 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖變化，采用48小時(shí)50％抑制率的藥物濃度（IC50）作用于骨髓瘤細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)48小時(shí)后骨髓瘤細(xì)胞周期和凋亡的變化，real-time PCR、western blot檢測(cè)ATRA作用后骨髓瘤細(xì)胞miR16和CDC25B表達(dá)情況。
　　結(jié)果：（1）收集臨床確診的初治多發(fā)性骨髓瘤患者和正常供者的骨髓標(biāo)本，基因芯片和Western blot檢測(cè)顯示，多發(fā)性骨髓瘤

6、患者CDC25B明顯高表達(dá)。（2）real-time PCR和western blot結(jié)果顯示，CDC25B mRNA和蛋白水平表達(dá)在骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226中明顯高于U266；real-time PCR結(jié)果顯示miR-16在骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226中表達(dá)明顯低于U266。由此，我們選用RPMI8226作為細(xì)胞模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（3）成功構(gòu)建、包裝高表達(dá)GA248-shRNA-CDC25B的慢病毒，感染骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226并建

7、立穩(wěn)定細(xì)胞株；real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示干擾組細(xì)胞 CDC25B mRNA和蛋白水平表達(dá)均明顯下調(diào)，shRNA-CDC25B干擾成功。（4）CDC25B基因沉默后對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響：①CCK8結(jié)果顯示：與空載對(duì)照組相比，基因沉默后 RPMI8226細(xì)胞增殖受抑，24～96小時(shí)抑制率為25.41～28.22%；②FCM檢測(cè)細(xì)胞周期顯示：RPMI8226對(duì)照組和干擾組 G2/M期細(xì)胞比例

8、分別為9.21±0.09%和32.60±2.93%（P＜0.05）；③FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示：RPMI8226對(duì)照組和干擾組細(xì)胞凋亡率分別為：17.28%和35.31%。（5）熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)高表達(dá) miR-16對(duì)CDC25B的影響：miR-16靶向 CDC25B3’UTR。（6）成功構(gòu)建并包裝高表達(dá)miR-16慢病毒，感染骨髓瘤細(xì)胞RPMI8226并建立穩(wěn)定細(xì)胞株。real-time PCR結(jié)果顯示：高表達(dá)miR-16組細(xì)胞miR

9、-16表達(dá)上調(diào)約1448.15倍，過表達(dá)miR-16成功；real-time PCR和western blot結(jié)果顯示：CDC25B在mRNA和蛋白水平表達(dá)均下調(diào)，miR-16靶向抑制CDC25B成功。（7）miR-16靶向抑制CDC25B后對(duì)骨髓瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響：①CCK8顯示：與對(duì)照組相比，RPMI8226干擾組細(xì)胞增殖受抑，24～72小時(shí)增殖抑制率為18.78～30.74%；②FCM檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示：RPM

10、I8226對(duì)照組和干擾組 G2/M期細(xì)胞比例分別為15.00±3.14%和29.90±3.60%（P＜0.05）；③FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：RPMI8226細(xì)胞對(duì)照組和干擾組凋亡率分別為：17.10%和32.84%。（8）ATRA對(duì) RPMI8226細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響:①不同濃度（0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）ATRA作用于RPMI8226后2

11、4～96小時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制率分別為7.17～37.95%、8.42～54.09%、14.38～66.65%、17.01～74.46%、20.04～83.12%、26.20～88.52%，48小時(shí) IC50約為3μmol/L；②3μmol/L ATRA作用于RPMI822648小時(shí)，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞周期顯示：對(duì)照組和ATRA組 G2/M期細(xì)胞比率分別為9.67±0.94%和18.91±1.77%（P＜0.05）；FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示

12、：對(duì)照組和ATRA組凋亡率分別為18.66%和33.46%。（9）3μmol/L ATRA作用于RPMI822648小時(shí)后，real-time PCR顯示：miR-16表達(dá)上調(diào)，CDC25B mRNA表達(dá)下調(diào)；Western blot顯示：CDC25B蛋白水平表達(dá)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：（1）在多發(fā)性骨髓瘤中高表達(dá)的CDC25B有可能成為骨髓瘤治療的新基因靶標(biāo)；（2）CDC25B沉默后RPMI8226骨髓瘤細(xì)胞株表現(xiàn)為細(xì)胞增殖受抑，