eRF3b對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠非酒精性脂肪肝保護(hù)作用的脂肪代謝機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）的患病率逐年上升，已成為最常見的慢性肝臟疾病。根據(jù)疾病嚴(yán)重程度，NAFLD可包括以下類型：?jiǎn)渭冃愿沃静∽?，非酒精性肝炎，肝纖維化，肝細(xì)胞肝癌。目前普遍認(rèn)為NAFLD的發(fā)生涉及飲食、遺傳、腸道微生物等因素，它們可作為“多重打擊”共同影響脂肪代謝、炎癥及纖維化的形成，從而引起肝毒性。
　　本研究室前期采用飛行質(zhì)譜技術(shù)在慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中檢測(cè)到一種生物學(xué)標(biāo)志物：真核肽鏈釋放

2、因子3b（eRF3b）多肽，該標(biāo)志物在不同類型患者體內(nèi)表達(dá)有差異。前期研究發(fā)現(xiàn)eRF3b對(duì)免疫性肝損傷、肝纖維化均有保護(hù)作用。
　　基于本實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于eRF3b對(duì)NAFLD保護(hù)性作用的研究，發(fā)現(xiàn)eRF3b可減輕高脂飲食聯(lián)合四氯化碳導(dǎo)致的大鼠肝內(nèi)脂肪沉積，改善血清學(xué)和組織病理學(xué)指標(biāo)，但是eRF3b發(fā)揮保護(hù)作用的具體分子機(jī)制尚不明確，所以本次研究主要通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體/肝X受體（PPA

3、R/LXR）通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）通路來(lái)探索eRF3b對(duì)非酒精性脂肪肝病的保護(hù)作用的脂肪代謝機(jī)制，從而為非酒精性脂肪肝病的治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法：
　　1.脂肪代謝通路相關(guān)因子基因表達(dá)水平變化：
　　應(yīng)用qRT-PCR方法測(cè)定正常組、模型組、eRF3b100μg/kg組、200μg/kg組、400μg/kg組、西藥（復(fù)方甘草酸苷）對(duì)照組、中藥（降脂通絡(luò)軟膠囊）對(duì)照組凍存肝組

4、織中AMPK通路相關(guān)指標(biāo)adiponectin、LKB1、AMPKα1、AMPKα2、ACC、CPT1、SREBP-1c、FAS、PNPLA3；PPAR/LXR通路指標(biāo)PPARα、PPARγ、LXRα；炎癥、纖維化與細(xì)胞增殖指標(biāo)IL-6、TGF-β1、collagen1、PCNA的基因表達(dá)水平。
　　2.幾種相關(guān)因子蛋白水平的變化：
　　應(yīng)用Western-blot方法測(cè)定正常組、模型組、eRF3b100μg/kg組、200

5、μg/kg組、400μg/kg組、復(fù)方甘草酸苷組、降脂通絡(luò)軟膠囊組凍存肝組織中的p-AMPKα/AMPKα、PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.各組AMPKα的基因及蛋白表達(dá)水平
　　qRT-PCR結(jié)果顯示模型組與正常組比AMPKα1、AMPKα2 mRNA相對(duì)表達(dá)均降低（P<0.01），eRF3b100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg組、復(fù)方甘草酸苷組、降脂通絡(luò)軟膠囊組與模型

6、組比，AMPKα1、AMPKα2 mRNA相對(duì)表達(dá)均升高（P<0.01）。eRF3b200μg/kg組AMPKa1和AMPKα2 mRNA表達(dá)高于復(fù)方甘草酸苷組和降脂通絡(luò)軟膠囊組（P<0.05）。Western-blot結(jié)果顯示模型組p-AMPKα/AMPKα蛋白相對(duì)表達(dá)量低于正常組（P<0.01）， eRF3b200μg/kg組與模型組比p-AMPKα/AMPKα蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）。
　　2.各組AMPK上游基因

7、的表達(dá)水平
　　與正常組比，模型組adiponectin與LKB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低（P<0.05），eRF3b200μg/kg組adiponectin和LKB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組（P<0.01）。
　　3.各組脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平
　　與正常組比，模型組ACC mRNA相對(duì)表達(dá)升高，CPT1 mRNA相對(duì)表達(dá)降低（P<0.001）。與模型組比，eRF3b100μg/kg、200μg/kg

8、、400μg/kg組、復(fù)方甘草酸苷組、降脂通絡(luò)軟膠囊組ACC mRNA相對(duì)表達(dá)量降低， CPT1 mRNA相對(duì)表達(dá)升高，且eRF3b400μg/kg組ACC mRNA表達(dá)低于與復(fù)方甘草酸苷組（P<0.05）。
　　4.各組脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)水平
　　與正常組比，模型組SREBP-1c、PNPLA3、FAS mRNA相對(duì)量表達(dá)均升高（P<0.05）。與模型組比，eRF3b100μg/kg、200μg/kg、400μg/k

9、g組、復(fù)方甘草酸苷組、降脂通絡(luò)軟膠囊組SREBP-1c、FAS、PNPLA3 mRNA表達(dá)均降低（P<0.05），且eRF3b200μg/kg組和400μg/kg組SREBP-1c mRNA水平低于復(fù)方甘草酸苷組（P<0.05）。
　　5.各組PPAR/LXR通路的基因表達(dá)水平
　　正常組、模型組、eRF3b100μg/kg組、200μg/kg組、400μg/kg組、復(fù)方甘草酸苷組、降脂通絡(luò)軟膠囊組的PPARα與LXRα基因

10、相對(duì)表達(dá)水平均無(wú)差異（P>0.05）。模型組PPARγmRNA水平高于正常組（P<0.001），與模型組比，eRF3b200μg/kg組與降脂通絡(luò)軟膠囊組PPARγmRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P<0.05）。
　　6.各組PI3K/Akt通路的蛋白表達(dá)水平
　　Western blot結(jié)果顯示，正常組、模型組、eRF3b100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg組、復(fù)方甘草酸苷組、降脂通絡(luò)軟膠囊組PI3K和p-Akt/

11、Akt的蛋白相對(duì)表達(dá)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　7.各組炎癥、纖維化及細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)水平
　　與正常組比，模型組IL-6、TGF-β1、collagen1 mRNA相對(duì)表達(dá)均升高（P<0.01）。與模型組比，eRF3b100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg組、西藥組、中藥組IL-6和TGF-β1 mRNA表達(dá)降低（P<0.05）；eRF3b100μg/kg、200μg/kg組、復(fù)方甘草酸苷組

12、、降脂通絡(luò)軟膠囊組collagen1 mRNA表達(dá)降低（P<0.01），且eRF3b200μg/kg組IL-6和collagen1基因水平低于復(fù)方甘草酸苷組和降脂通絡(luò)軟膠囊組（P<0.01）。各組PCNA的基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.eRF3b可能通過(guò)激活A(yù)MPK通路，降低肝內(nèi)PPARγ的表達(dá)而改善脂代謝并減輕由高脂飲食聯(lián)合四氯化碳引起的大鼠肝臟炎癥反應(yīng)與纖維化的發(fā)生，發(fā)揮對(duì)脂肪肝的保護(hù)作用。