Chemerin對(duì)MCD飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的干預(yù)及機(jī)制研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）作為代謝綜合征的一種，其發(fā)病率逐年升高，已成為社會(huì)的公共健康問題。大量的文獻(xiàn)報(bào)道，NAFLD的發(fā)病與多種脂肪因子如：adiponectin、leptin、resistin等有關(guān)。Chemerin作為新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，研究發(fā)現(xiàn)其在肝臟與脂肪組織中高表達(dá)。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，chemerin在膽堿-蛋氨酸缺乏（methionin

2、e-choline-deficient，MCD）飼料喂養(yǎng)Wistar大鼠肝臟中其mRNA的表達(dá)是下調(diào)的，在高脂喂養(yǎng)C57BL/6小鼠及db/db鼠肝臟中也觀察到了相同的現(xiàn)象；而在高脂小鼠及db/db小鼠脂肪組織中其表達(dá)反而是上升的；這些現(xiàn)象提示chemerin的表達(dá)可能具有組織特異性。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外及體內(nèi)模型來研究chemerin在非酒精性脂肪肝模型中對(duì)肝臟損傷的作用。
　　 方法：⑴培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，加入棕櫚酸（pal

3、mitic acid，PA）建立脂肪肝的體外模型，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Polymerase Chain Reaction，real-time PCR）檢測細(xì)胞因子chemerin mRNA水平的表達(dá)變化；用western blot檢測chemerin 蛋白水平的表達(dá)變化。⑵在HepG2細(xì)胞、小鼠原代肝細(xì)胞中加入FXR激動(dòng)劑GW4064，觀察其對(duì)chemerin表達(dá)的影響。采用real-time PCR及we

4、stern blot分別檢測chemerin的mRNA及蛋白水平的表達(dá)變化。運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因方法和染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）方法驗(yàn)證FXR對(duì)chemerin的調(diào)控作用。⑶30只C57BL/6小鼠分為3組：普通飼料組（Ctrl, n=6）、模型組（MCD, n=12）和藥物組（Chemerin，n=12）。Ctrl組喂養(yǎng)普通飼料，MCD模型組和藥物組喂養(yǎng)MCD飼料3周后，分

5、別腹腔注射1×PBS及重組chemerin3周。檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)及肝臟膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）含量，并做HE染色及油紅染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積的變化；采用Real-time PCR檢測脂質(zhì)氧化及合成代謝的相關(guān)基因的表達(dá)變化。⑷

6、經(jīng)PCR方法得到chemerin基因，將其插入到帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein ，GFP）基因的穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1中，得到重組質(zhì)粒pShuttle-chemerin-IRES -hrGFP-1。通過酶切的方法線性化pShuttle-chemerin-IRES -hrGFP-1，并將其轉(zhuǎn)化于含有pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行同源重組。得到的重組腺

7、病毒表達(dá)載體Ad-chemerin，經(jīng)PacI線性化后，轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。通過western blot方法分析chemerin蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪肝模型中，chemerin mRNA和蛋白的表達(dá)水平下降。②FXR激動(dòng)劑作用于HepG2細(xì)胞及小鼠原代肝細(xì)胞后，能夠促進(jìn)chemerin mRNA 及蛋白水平的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了FXR對(duì)chemerin的調(diào)控

8、作用。③與MCD模型組相比，藥物組小鼠體重、肝臟重量及肝重體重比都有所上升；血清ALT、AST、TC、TG含量都有所下降；HE染色和油紅染色顯示肝臟脂質(zhì)沉積減少，脂滴形狀也變?。籖eal-time PCR結(jié)果也表明肝臟脂肪氧化相關(guān)基因、脂肪氧化磷酸化相關(guān)基因表達(dá)都上升；而脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)下降。④得到重組腺病毒Ad-chemerin，轉(zhuǎn)染重組腺病毒的AD293細(xì)胞經(jīng)熒光顯微鏡能觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光，且出現(xiàn)細(xì)胞病變反應(yīng)（cytopa

9、thic effect，CPE），western blotting實(shí)驗(yàn)檢測到 chemerin蛋白的表達(dá)，從而證實(shí)重組腺病毒載體構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論：NAFLD中肝臟chemerin的表達(dá)變化可能與肝臟脂質(zhì)沉積有關(guān)；chemerin可能參與了NAFLD的發(fā)病。Chemerin對(duì)NAFLD肝臟損傷有一定的保護(hù)作用。核受體FXR對(duì)chemerin的表達(dá)起到了一定的調(diào)控作用。Chemerin重組腺病毒載體構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究che