Chemerin對MCD飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝的干預(yù)及機制研究.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）作為代謝綜合征的一種，其發(fā)病率逐年升高，已成為社會的公共健康問題。大量的文獻報道，NAFLD的發(fā)病與多種脂肪因子如：adiponectin、leptin、resistin等有關(guān)。Chemerin作為新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，研究發(fā)現(xiàn)其在肝臟與脂肪組織中高表達。本課題組前期的實驗研究發(fā)現(xiàn)，chemerin在膽堿-蛋氨酸缺乏（methionin

2、e-choline-deficient，MCD）飼料喂養(yǎng)Wistar大鼠肝臟中其mRNA的表達是下調(diào)的，在高脂喂養(yǎng)C57BL/6小鼠及db/db鼠肝臟中也觀察到了相同的現(xiàn)象；而在高脂小鼠及db/db小鼠脂肪組織中其表達反而是上升的；這些現(xiàn)象提示chemerin的表達可能具有組織特異性。因此，本實驗通過體外及體內(nèi)模型來研究chemerin在非酒精性脂肪肝模型中對肝臟損傷的作用。
　　 方法：⑴培養(yǎng)HepG2細胞，加入棕櫚酸（pal

3、mitic acid，PA）建立脂肪肝的體外模型，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time Polymerase Chain Reaction，real-time PCR）檢測細胞因子chemerin mRNA水平的表達變化；用western blot檢測chemerin 蛋白水平的表達變化。⑵在HepG2細胞、小鼠原代肝細胞中加入FXR激動劑GW4064，觀察其對chemerin表達的影響。采用real-time PCR及we

4、stern blot分別檢測chemerin的mRNA及蛋白水平的表達變化。運用熒光素酶報告基因方法和染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）方法驗證FXR對chemerin的調(diào)控作用。⑶30只C57BL/6小鼠分為3組：普通飼料組（Ctrl, n=6）、模型組（MCD, n=12）和藥物組（Chemerin，n=12）。Ctrl組喂養(yǎng)普通飼料，MCD模型組和藥物組喂養(yǎng)MCD飼料3周后，分

5、別腹腔注射1×PBS及重組chemerin3周。檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)及肝臟膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）含量，并做HE染色及油紅染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積的變化；采用Real-time PCR檢測脂質(zhì)氧化及合成代謝的相關(guān)基因的表達變化。⑷

6、經(jīng)PCR方法得到chemerin基因，將其插入到帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein ，GFP）基因的穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1中，得到重組質(zhì)粒pShuttle-chemerin-IRES -hrGFP-1。通過酶切的方法線性化pShuttle-chemerin-IRES -hrGFP-1，并將其轉(zhuǎn)化于含有pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細胞中，進行同源重組。得到的重組腺

7、病毒表達載體Ad-chemerin，經(jīng)PacI線性化后，轉(zhuǎn)染AD293細胞進行擴增。通過western blot方法分析chemerin蛋白的表達。
　　 結(jié)果：①PA誘導(dǎo)的HepG2細胞脂肪肝模型中，chemerin mRNA和蛋白的表達水平下降。②FXR激動劑作用于HepG2細胞及小鼠原代肝細胞后，能夠促進chemerin mRNA 及蛋白水平的表達。熒光素酶報告基因?qū)嶒灱癈hIP實驗結(jié)果驗證了FXR對chemerin的調(diào)控

8、作用。③與MCD模型組相比，藥物組小鼠體重、肝臟重量及肝重體重比都有所上升；血清ALT、AST、TC、TG含量都有所下降；HE染色和油紅染色顯示肝臟脂質(zhì)沉積減少，脂滴形狀也變小；Real-time PCR結(jié)果也表明肝臟脂肪氧化相關(guān)基因、脂肪氧化磷酸化相關(guān)基因表達都上升；而脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達下降。④得到重組腺病毒Ad-chemerin，轉(zhuǎn)染重組腺病毒的AD293細胞經(jīng)熒光顯微鏡能觀察到細胞內(nèi)有綠色熒光，且出現(xiàn)細胞病變反應(yīng)（cytopa

9、thic effect，CPE），western blotting實驗檢測到 chemerin蛋白的表達，從而證實重組腺病毒載體構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論：NAFLD中肝臟chemerin的表達變化可能與肝臟脂質(zhì)沉積有關(guān)；chemerin可能參與了NAFLD的發(fā)病。Chemerin對NAFLD肝臟損傷有一定的保護作用。核受體FXR對chemerin的表達起到了一定的調(diào)控作用。Chemerin重組腺病毒載體構(gòu)建成功，為進一步研究che