受體酪氨酸激酶在霍奇金淋巴瘤中作用的研究.pdf

1、目的：
　　經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(cHL)是一種B細(xì)胞來(lái)源淋巴瘤，它的特點(diǎn)是少數(shù)腫瘤細(xì)胞周圍被占絕大多數(shù)的反應(yīng)性細(xì)胞所包圍。這些反應(yīng)性細(xì)胞提供支持HRS細(xì)胞（霍奇金細(xì)胞和鏡影細(xì)胞）生存和生長(zhǎng)的微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境之間的相互作用包括多個(gè)受體酪氨酸激酶(RTK)的異常活動(dòng)。胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)是RTK的一種，它在許多惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡保護(hù)和化療耐藥中起著重要的作用。IGF-1R通路除了促進(jìn)增值的作用，它

2、與上皮細(xì)胞的高分化相關(guān)。IGF-Ⅰ促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，而IGF-Ⅰ對(duì)分化的影響可能通過(guò)ERK通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。我們假設(shè)有一個(gè)共表達(dá)受體抑制IGF-1R的ERK通路。有報(bào)道ephrin配體與Eph受體的接合導(dǎo)致的通過(guò)Ras-ERK途徑影響IGF-1R分化作用。因此有必要對(duì)兩種RTK受體同時(shí)研究。Ephrin家族是酪氨酸激酶最大的成員，近年來(lái)它對(duì)腫瘤研究引起越來(lái)越大的興趣。Ephrin的獨(dú)特之處是，Eph受體和ephrin配體都是結(jié)合在細(xì)胞膜上

3、，激活的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，一般發(fā)生在直接接觸的細(xì)胞之間，并且具有雙向信號(hào)傳導(dǎo)。Ephrin在許多細(xì)胞活動(dòng)中起關(guān)鍵作用包括細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和粘附。在這項(xiàng)研究中，我們?cè)u(píng)估了在cHL中IGF-1R的表達(dá)、預(yù)后意義和功能。最近的研究發(fā)現(xiàn)在人類惡性腫瘤中Ephrin的表達(dá)提高或缺失。Ephrin對(duì)霍奇金淋巴瘤HRS細(xì)胞的作用是未知的，本研究中我們同時(shí)對(duì)Eph受體和Ephrin配體在霍奇金淋巴瘤的表達(dá)進(jìn)行研究。
　　方法:
　　1.在80例cHL病

4、例組織中應(yīng)用免疫組化技術(shù)進(jìn)行IGF-1R抗體染色。采用卡方、Fisher確切概率檢驗(yàn)和Mann-Whitney檢驗(yàn)分析IGF-1R的表達(dá)與臨床資料關(guān)系，使用Kaplan-Meier的方法計(jì)算生存曲線。用Western印跡分析來(lái)確定三個(gè)cHL細(xì)胞系（L428、L1236和KMH2）的IGF-1R表達(dá)水平，并用ELISA法測(cè)定三個(gè)cHL細(xì)胞系的IGF-1分泌。用Alamar藍(lán)檢測(cè)IGF-1或cyclolignan picropodophyl

5、lin（PPP，一種高度選擇性的IGF-1R抑制劑）處理后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析PPP處理后細(xì)胞周期分布，Western印跡法評(píng)估IGF-1或PPP處理后IGF-1R和關(guān)鍵的下游信號(hào)分子變化。
　　2.在霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系使用定量PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)染色，以確定在霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系在RNA水平和蛋白水平的Ephrin家族表達(dá)模式。我們總共使用了8個(gè)HL細(xì)胞系，并測(cè)試這些細(xì)胞系七個(gè)EphA受體(A1-A7)、五個(gè)EphB受

6、體(B1-B5)、五個(gè)ephrinA配體(A1-A5)和三個(gè)ephrinB配體(B1-B3)的表達(dá)。通過(guò)定量PCR在2例NLP病人和2例CHL病人冰凍組織中分析了Ephrin家族成員在HL組織中的表達(dá)。根據(jù)這一結(jié)果在5例NLP-HL標(biāo)本和25例cHL標(biāo)本中進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.cHL患者中有55％(44/80)檢測(cè)到IGF-1R陽(yáng)性表達(dá)。IGF-1R表達(dá)在cHL亞型有一個(gè)顯著差異(P=0.0157)，結(jié)節(jié)性

7、硬化陽(yáng)型病例的比例高(38/61)而混合細(xì)胞性病例陽(yáng)性的比例低(1/9)。IGF-1R表達(dá)與年齡，EBV狀態(tài)或Ann Arbor分期之間沒(méi)有相關(guān)性。IGF-1R陽(yáng)性患者組的總生存率(OS)為98％，而IGF-1R陰性患者組總生存率(OS)為83％(p=0.029)。IGF-1R陽(yáng)性患者的5年無(wú)進(jìn)展生存率(PFS)為93％，而在IGF-1R陰性患者的5年P(guān)FS分別為77％(P=0.047)。所有三個(gè)cHL細(xì)胞系均顯示IGF-1R的表達(dá)，L

8、428表達(dá)水平最高。3個(gè)細(xì)胞系中IGF1的分泌水平是相似的。IGF-1對(duì)L428的細(xì)胞增殖有最明顯的影響(增加31％)，而在其他2個(gè)細(xì)胞系僅有很小的影響。L428細(xì)胞對(duì)IGF-1最敏感，這與其IGF-1R表達(dá)水平高相一致。PPP（2μM）處理72小時(shí)后，在所有3個(gè)cHL細(xì)胞系的活力和增殖能力下降，L428細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)，細(xì)胞增殖減少了48％。PPP誘導(dǎo)所有3個(gè)細(xì)胞系的G2/M細(xì)胞周期阻滯。IGF-1刺激30分鐘，L428細(xì)胞的IGF-

9、1R、Akt和ERK磷酸化上調(diào)。PPP處理降低L428細(xì)胞IGF-1R和Akt磷酸化，而ERK磷酸化上調(diào)。PPP也降低了pCdc2(Thr14/Tyr15)，并上調(diào)cyclinB1的表達(dá)，這與G2/M-phase細(xì)胞周期阻滯是一致的。
　　2.在RNA水平:霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系中表達(dá)除EphA2和ephrinB3外的所有ephrin家族成員;EphB1、EphB2、EphB4和ephrinA5表達(dá)在腫瘤微環(huán)境中。根據(jù)8種HL細(xì)胞系q

10、PCR和免疫化學(xué)的表達(dá)模式我們選擇了感興趣的Ephrin家族成員。我們通過(guò)免疫組化研究5例NLP-HL和25例cHL組織EPHA1、EPHA3、EPHB1受體和ephrinA3、ephrinA4和ephrinB1配體的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)了結(jié)節(jié)性淋巴細(xì)胞為主型(NLP-HL)和經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤(cHL)不同的表達(dá)模式。NLP-HL沒(méi)有表達(dá)ephrinA3，而cHL表達(dá)ephrinA3。相反，NLP-HL表達(dá)EPHA1，而cHL并沒(méi)有表達(dá)EP

11、HA1。免疫組化顯示除了表達(dá)在腫瘤細(xì)胞ephrin家族廣泛表達(dá)在霍奇金淋巴瘤的腫瘤微環(huán)境中。
　　結(jié)論:
　　1.我們發(fā)現(xiàn)，IGF-1R表達(dá)在55％cHL患者中，在結(jié)節(jié)硬化型中具有較高的比例。在cHL細(xì)胞系中同時(shí)表達(dá)IGF-1R和IGF-1。盡管霍奇金細(xì)胞系中IGF-1R具有促進(jìn)增殖作用，PPP作用后G2/M期細(xì)胞的比例增加，IGF-1R在腫瘤組織HRS細(xì)胞中的表達(dá)則提示良好的預(yù)后。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)ephrin家族的