受體酪氨酸激酶Mer的基礎(chǔ)和臨床研究.pdf

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文受體酪氨酸激酶Mer的基礎(chǔ)和臨床研究姓名：范磊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科血液學(xué)指導(dǎo)教師：阮長(zhǎng)耿20070401受體酪氨酸激酶Mcr的基礎(chǔ)和臨床研究摘要26kD，表達(dá)量約占總菌體總蛋白的15％，并主要以包涵體形式存在。Westernblot顯示該重組蛋白可以被antiHis抗體特異性識(shí)別。2受體酪氨酸激酶Met單克隆抗體的制各、鑒定和初步功能研究利用本科室已經(jīng)建立的雜交瘤技術(shù)，將重組McrIgG樣區(qū)蛋白經(jīng)次氮基三乙酸

2、鎳瓊脂糖(NiNTAagarose)柱純化濃縮后免疫Balb／c小鼠，尾靜脈加強(qiáng)后取脾細(xì)胞融合，ELISA法篩選陽(yáng)性克隆，制備腹水。運(yùn)用Wcstcmblot對(duì)抗體進(jìn)行鑒定觀察抗體與原核重組蛋白、真核重組胞外區(qū)全長(zhǎng)蛋白以及細(xì)胞裂解液中天然Met反應(yīng)情況，并進(jìn)行免疫亞型鑒定和組織特異性鑒定。同時(shí)將所制各的抗體與PRP孵育以檢測(cè)其對(duì)于血小板聚集功能的影響。結(jié)果可以看出：小鼠脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合后篩選獲得一株持續(xù)分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為

3、SZ128。該株雜交瘤細(xì)胞單克隆后接種小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，間接ELISA法測(cè)定腹水效價(jià)為l1礦瓊脂糖雙擴(kuò)散法顯示該株抗體為19in亞類。腹水經(jīng)蛋白GSephrose4B親和層析柱純化后濃度分別為08mg／ml。SZ128單抗能夠特異性的識(shí)別相對(duì)分子量為26kD的重組MetIgG樣區(qū)蛋白、Mcr真核重組胞外區(qū)全長(zhǎng)蛋白以及Jurkat和K562細(xì)胞裂解液中天然Mcr蛋白。免疫組化提示：Met在前列腺、肺臟和腎臟組織高表達(dá)，而在脾臟、小腸、大腸

4、、肝臟和扁桃體表達(dá)較低，在食道的平滑肌幾乎沒(méi)有表達(dá)。血小板聚集實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)SZ128和血小板PI心孵育以后可以抑制ADP(21anoFL)和瑞斯托霉素(125mg／m1)誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制率分別為302％士85％和2560／甜：74％(SZ128終濃度均為50pg／mD，并且在20嶺／Inl、50肛g／ml和100嵋，lIll不同劑量組之間抑制血小板聚集的效應(yīng)沒(méi)有明顯的量效關(guān)系，這種現(xiàn)象可能因?yàn)镚as6／Mer信號(hào)途徑本身并不直接參與

5、血小板聚集而只是血小板聚集的中后期起到信號(hào)放大作用有關(guān)。二、受體酪氨酸激酶Mer對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)1Met對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響凋亡是正常機(jī)體內(nèi)細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程，是體內(nèi)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括Mcr家族成員Axl在內(nèi)的多種受體酪氨酸激酶參與正常細(xì)胞的凋亡過(guò)程，其中大多數(shù)是生長(zhǎng)因子受體。為了探討Mcr對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，首先利用經(jīng)典的生長(zhǎng)因子撤離的方法誘導(dǎo)HMC1(人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞株)發(fā)生凋亡，并利用定量PC