Crif1在骨肉瘤細(xì)胞U2OS輻射損傷抵抗中的作用及機(jī)制初步研究.pdf

1、目的:
　　明確Crif1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞輻射損傷抵抗并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.免疫組化檢測(cè)骨肉瘤組織及放射敏感性較強(qiáng)的肺癌組織的Crif1表達(dá)情況,定量PCR、Western Blot方法檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞株U2OS、其他腫瘤細(xì)胞株HepG2(肝癌)、PLC(肝癌)、A549(肺癌)、Jurkat(白血病)以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 BMSCs、腎小管上皮細(xì)胞株HK2中Crif1基因及蛋白表達(dá),初步闡明Cri

2、f1與細(xì)胞輻射敏感性之間的聯(lián)系。
　　2.體外模擬細(xì)胞輻射損傷,RNAi慢病毒載體感染U2OS細(xì)胞,抑制Crif1基因表達(dá),CCK8方法檢測(cè)輻射前后細(xì)胞增殖情況,流式及 TUNEL法檢測(cè)輻射前后細(xì)胞凋亡,證實(shí)Crif1在U2OS細(xì)胞輻射損傷抵抗中的作用。
　　3.流式檢測(cè)輻射前后U2OS細(xì)胞周期分布,通過構(gòu)建Crif1及CDK2原核表達(dá)載體,并進(jìn)行GST pull down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者之間的相互結(jié)合,免疫熒光觀察CDK2輻射

3、前后細(xì)胞亞定位,研究Crif1可能CDK2途徑調(diào)控細(xì)胞周期參與U2OS輻射損傷抵抗。
　　4.流式及免疫熒光檢測(cè) U2OS輻射前后細(xì)胞 ROS累積,同時(shí)通過定量 PCR及Western Blot方法檢測(cè)輻射前后 Crif1、Nrf2基因及蛋白表達(dá),并通過定量PCR檢測(cè)NRF2下游 II相解毒酶相關(guān)基因 HO-1、GSTA、GCLC表達(dá),研究 Crif1保護(hù) U2OS免于輻射損傷可能與其調(diào)控氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　結(jié)果:
　

4、　1.免疫組化研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),Crif1在骨肉瘤組織中的表達(dá)顯著高于肺癌組織;在所研究的7種不同細(xì)胞系中,Crif1基因在骨肉瘤細(xì)胞株U2OS中表達(dá)明顯高于其他細(xì)胞(p<0.01)。以U2OS細(xì)胞Crif1基因表達(dá)為1,其他細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量由高至低分別為BMSCs0.48±0.05、PLC0.19±0.02、HepG20.14±0.02、HK20.08±0.01、A5490.05±0.007、Jurkat0.02±0.005,蛋白表達(dá)水平

5、與mRNA水平一致。
　　2.4Gy輻射條件下,U2OS細(xì)胞增殖受到抑制,干擾Crif1表達(dá),抑制加劇。9Gy輻射能夠誘導(dǎo) U2OS細(xì)胞凋亡,干擾 Crif1表達(dá)后,凋亡率增加更為顯著,且隨著時(shí)間增加而增加(0h5.43±1.52％,24h31.67±4.28%,48h44.30±7.54%,p<0.01)。
　　3.9Gy輻射誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯(對(duì)照組0h48.8±4.72%,24h55.32±6.17%

6、,48h56.58±6.22%,p<0.05;空病毒組0h48.2±3.98%,24h52.63±5.77%,48h57.90±7.18%,p<0.05),干擾Crif1表達(dá),能部分抑制輻射誘導(dǎo)的G0/G1阻滯(0h33.17±3.25%,24h33.28±3.38%,48h34.91±4.01%,p>0.05)。GST pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí),Crif1能夠直接與 CDK2結(jié)合。輻射后,能觀察到明顯的 CDK2核轉(zhuǎn)位,抑制Crif

7、1表達(dá)后,CDK2核轉(zhuǎn)位明顯減少。
　　4.9Gy輻射后U2OS細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS,Crif1與Nrf2及下游II相解毒酶HO-1、GCLC、GSTA的表達(dá)顯著升高,而干擾Crif1表達(dá)后,ROS產(chǎn)生增加,Nrf2及下游基因表達(dá)未見明顯升高。
　　結(jié)論:
　　1. Crif1在骨肉瘤組織及U2OS細(xì)胞中的高表達(dá)可能與其輻射損傷抵抗有關(guān)。
　　2.體外輻射實(shí)驗(yàn)證實(shí),干擾Crif1之后,能夠抑制U2OS細(xì)胞增殖,促進(jìn)