印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細胞中的作用及分子機制研究.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是常見的骨的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，其發(fā)病率占惡性骨腫瘤總數(shù)的20%，占兒童腫瘤總數(shù)的5%。骨肉瘤惡性程度高，早期即可發(fā)生廣泛的肺轉(zhuǎn)移，約20%的骨肉瘤患者發(fā)生可被影像學(xué)方法檢測的肺轉(zhuǎn)移，而80%的骨肉瘤患者在單純手術(shù)切除后發(fā)生轉(zhuǎn)移。肺轉(zhuǎn)移引起的呼吸衰竭是導(dǎo)致骨肉瘤死亡的常見原因。研究發(fā)現(xiàn)許多致病因素如化學(xué)因素、放射性物質(zhì)、病毒感染等均能誘導(dǎo)骨肉瘤的發(fā)生。同時在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨著一系列

2、的基因和表觀遺傳學(xué)的改變，但這一系列的改變不具有一致性。因而目前的觀點認為，骨肉瘤的發(fā)生是一個多階段演進和多基因參與的過程，但確切的發(fā)病機制尚未闡明。隨著腫瘤病因?qū)W研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤不僅是一種遺傳有關(guān)的疾病，同時也是一種表遺傳性疾病，幾乎所有的腫瘤中都有表觀遺傳的異常。其中印跡基因作為一種表遺傳學(xué)機制，以原癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生及演進，備受關(guān)注。
　　 近年來，隨著干細胞研究的不斷深入以及腫瘤干細胞理論的提出，越來越多

3、的證據(jù)顯示腫瘤是由其內(nèi)部的一小部分細胞所始動和維持的，這一小部分細胞被稱作腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)。和普通腫瘤細胞相比，腫瘤干細胞不僅具有自我更新和多向分化潛能，同時還具有誘導(dǎo)腫瘤形成的能力。自1994年Lapidot在白血病細胞中通過特異性細胞表面標(biāo)志分離出具有自我更新和維持其惡性能力的急性粒細胞性白血病干細胞以來，研究者們陸續(xù)從腦腫瘤、乳腺癌、消化道腫瘤、惡性黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等分離得到了腫瘤

4、干細胞。
　　 在間葉性腫瘤中，Gibbs等報道在骨肉瘤中存在一小部分具有自我更新能力，并能在無血清懸浮培養(yǎng)條件下形成腫瘤細胞球的細胞，這部分細胞高表達STAT3和多潛能干細胞標(biāo)記Oct3/4、Nanog，從而顯示出干細胞樣的特性。該研究將腫瘤干細胞學(xué)說擴展到了間葉來源的腫瘤，證實了肉瘤中腫瘤干細胞的存在。隨后陸續(xù)有多個實驗室以不同的方法證實了骨肉瘤腫瘤干細胞的存在。骨肉瘤干細胞為治愈骨肉瘤提供了可能，但也帶來了一系列難題，由于

5、骨肉瘤干細胞的放化療抵抗和高轉(zhuǎn)移特性，使得目前的治療手段都不能根治腫瘤。尋找可行的治療手段是目前面臨的關(guān)鍵問題。
　　 我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)印跡基因TSSC3(tumor-suppressing STF cDNA3)與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及抗失巢凋亡能力有關(guān)。TSSC3基因，又名IPL基因(imprinted inplacenta and liver)，定位于染色體11p15的胚胎腫瘤抑制區(qū)，屬PHLDA基因超家族，呈母系等位

6、基因表達，與TDAG51(T cell death associated gene51)高度同源，并含有與凋亡相關(guān)的PQ蛋白基序，推測TSSC3印跡基因在細胞凋亡中發(fā)揮作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞系SaOS2中TSSC3基因啟動子區(qū)CG位點的平均甲基化率高，用去甲基化藥物處理該細胞后TSSC3表達明顯增高，且細胞凋亡率也顯著增加。利用載體穩(wěn)定高表達TSSC3，發(fā)現(xiàn)高表達TSSC3在體外能抑制骨肉瘤細胞增殖，在體內(nèi)能抑制腫瘤生長，并通

7、過線粒體途徑誘導(dǎo)骨肉瘤細胞凋亡和增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用。但TSSC3在作為腫瘤起始細胞的腫瘤干細胞中的作用尚待研究。為了研究TSSC3在骨肉瘤干細胞中的作用及可能的分子機制，我們擬首先利用不同方法從MG63、SaOS2和惡性轉(zhuǎn)化的人成骨細胞hFOB1.19(MThFOB1.19)中分離鑒定出腫瘤干細胞，并檢測印跡基因TSSC3在干細胞中的表達，然后利用不同載體上調(diào)或下調(diào)骨肉瘤細胞中TSSC3的表達，最后檢測差異表達TSSC3對

8、骨肉瘤干細胞干性和凋亡的影響及其作用機制。
　　 有鑒于此，本研究分三部分進行：
　　 第一部分擬通過腫瘤干細胞成球培養(yǎng)和基于骨肉瘤干細胞表面標(biāo)記(CD133、CD117、Stro-1)的流式細胞儀分選方法從MG63、SaOS2和惡性轉(zhuǎn)化的人成骨細胞hFOB1.19(MThFOB1.19)中分離鑒定骨肉瘤干細胞。并根據(jù)MThFOB1.19細胞的高克隆形成特性，利用連續(xù)克隆形成和成瘤實驗從該細胞中分離出腫瘤干細胞，并對其自

9、我更新、多向分化和誘導(dǎo)腫瘤形成的能力進行檢測，通過免疫熒光、RT-PCR等技術(shù)進一步檢測干性相關(guān)因子的表達。為后續(xù)實驗提供細胞模型。
　　 第二部分擬采用RT-PCR、western-blot、免疫細胞化學(xué)、免疫熒光等實驗手段檢測不同方法所獲得的骨肉瘤干細胞中TSSC3的表達。采用RU486可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)穩(wěn)定上調(diào)MThFOB1.19骨肉瘤細胞系中TSSC3的表達，檢測高表達TSSC3對骨肉瘤細胞自我更新能力及成瘤能力的影響。以明

10、確TSSC3在腫瘤干細胞干性維持中的作用。
　　 第三部分擬采用不同載體穩(wěn)定上調(diào)或下調(diào)骨肉瘤細胞中TSSC3的表達，檢測凋亡相關(guān)印跡基因TSSC3對骨肉瘤干細胞凋亡的調(diào)控作用，以及在化療藥物順鉑的作用下，骨肉瘤干細胞凋亡率的變化，并以MThFOB1.19為模型，利用RT-PCR、免疫熒光、western-blot等檢測凋亡通路中相關(guān)分子的表達變化，以明確TSSC3誘導(dǎo)骨肉瘤干細胞凋亡的可能通路，進而尋找TSSC3誘導(dǎo)骨肉瘤干細胞

11、凋亡的可能機制。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 一、成功分離和鑒定出骨肉瘤干細胞
　　 1.采用干細胞培養(yǎng)法分離骨肉瘤干細胞，結(jié)果顯示：①在干細胞培養(yǎng)基中，MG63、SaOS2和MThFOB1.19細胞均能形成腫瘤干細胞球；②MThFOB1.19較MG63和SaOS2細胞具有更高的腫瘤干細胞形成率，分別為：67.09±9.28%，5.40±1.06%和8.60±1.16%；③MThFOB1.19腫瘤干細胞球高表達干

12、性因子Nanog.Oct4和Sox2；說明骨肉瘤干細胞可來源于分化的成骨細胞；
　　 2.在MThFOB1.19細胞中：①絕大部分細胞能形成克隆和亞克隆，比例分別為100%和92.7±4.29%，表明該細胞具有很強的自我更新能力；②克隆細胞成瘤能力強，5×104細胞即可誘導(dǎo)腫瘤形成；③具有向脂肪方向分化的能力；④細胞高表達干性因子Nanog、Oct4和Sox2，說明該細胞系中大部分細胞具有腫瘤起始細胞的特點；
　　 3.

13、采用干細胞表面標(biāo)記分選骨肉瘤干細胞，結(jié)果顯示：在SaOS2細胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+細胞比例分別為：0.4%、4.8%和3.3%，說明在該細胞中干性標(biāo)記陽性的細胞非常少，表明不同細胞系具有不同的腫瘤干細胞比例，與細胞本身特性相關(guān)。
　　 二、發(fā)現(xiàn)印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細胞中低表達，高表達TSSC3降低MThFOB1.19細胞的干性和抑制骨肉瘤生長
　　 1.印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細胞中

14、低表達：①在MG63、SaOS2和MThFOB1.19腫瘤干細胞球中，TSSC3在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達均較貼壁培養(yǎng)的細胞低；②在SaOS2細胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+細胞TSSC3的表達分別較CD133-、CD117-和Stro-1-細胞的表達低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明TSSC3基因的低表達可能在維持骨肉瘤腫瘤干細胞特殊功能中起重要作用；
　　 2.針對TSSC3，成功構(gòu)建RU486可誘導(dǎo)表達載體系統(tǒng)

15、。將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入MThFOB1.19細胞后，在濃度為1μg/ml的米非司酮誘導(dǎo)下，TSSC3的表達在mRNA水平和蛋白水平都明顯升高，最終在蛋白水平升高約5倍；
　　 3.在MThFOB1.19細胞中，高表達TSSC3降低骨肉瘤干細胞干性和抑制骨肉瘤生長：①高表達TSSC3降低干細胞球形成率，由66.12±9.36%減少到46.82±8.37%；②高表達TSSC3降低細胞的克隆形成率，由95.32±4.58%減少到57.57±2

16、.16%；③高表達TSSC3減少克隆中的細胞數(shù)量；④高表達TSSC3在體內(nèi)抑制骨肉瘤的生長，在第6周的時候，高表達TSSC3克隆來源的腫瘤體積較對照細胞來源的腫瘤體積減少約78.56%；⑤高表達TSSC3降低干性因子Nanog、Oct4和Sox2的表達；Nanog降低最為顯著，與對照相比降低了80%，Oct4和Sox2分別降低了20%和40%。
　　 三、高表達TSSC3通過線粒體途徑增加骨肉瘤干細胞自然凋亡率
　　 1

17、.差異表達SaOS2細胞中的TSSC3影響骨肉瘤干細胞比例：①在體外低表達TSSC3增加骨肉瘤干細胞比例，高表達TSSC3降低骨肉瘤干細胞比例；②在體內(nèi)高表達TSSC3降低骨肉瘤干細胞比例，低表達TSSC3增加骨肉瘤干細胞比例：
　　 2.高表達TSSC3通過線粒體途徑增加骨肉瘤干細胞的自然凋亡率：①高表達TSSC3增加SaOS2細胞中CD133+、CD117+和Stro-1+細胞的自然凋亡率；②高表達TSSC3增加MThFOB

18、1.19干細胞球中細胞的自然凋亡率；③高表達TSSC3增加MThFOB1.19干細胞球中Caspase3、Bak、Bim、Cytc、Apaf-1、Noxa和Puma的表達，增加Bax：Bcl2的比值，減少Caspase3前體蛋白和Caspase9前體蛋白，Caspase8前體蛋白無明顯改變；④高表達TSSC3降低MThFOB1.19干細胞球細胞的線粒體膜電位；
　　 3.高表達TSSC3增強化療藥物順鉑對SaOS2細胞中CD13

19、3+、CD117+和Stro-1+細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。
　　 主要的結(jié)論如下：
　　 1.大部分MThFOB1.19細胞具有腫瘤干細胞特性，表明骨肉瘤干細胞可來源于分化的成骨細胞；在不同骨肉瘤細胞系中，腫瘤干細胞的比例存在差異，與細胞本身特性相關(guān)；
　　 2.印跡基因TSSC3在骨肉瘤干細胞中低表達，表明TSSC3基因的低表達可能在維持骨肉瘤腫瘤干細胞特殊功能中起重要作用；高表達TSSC3可降低腫瘤干細胞干性抑制

20、腫瘤生長，提示TSSC3可成為靶向腫瘤干細胞治療的靶點。
　　 3.高表達TSSC3通過線粒體途徑增加骨肉瘤干細胞的自然凋亡率，并增加化療藥對骨肉瘤干細胞的殺傷作用，提示可通過激活TSSC3基因的表達而發(fā)揮對骨肉瘤細胞的抗腫瘤作用。深入研究TSSC3誘導(dǎo)骨肉瘤干細胞凋亡的機制，可為骨肉瘤的治療策略提供新的思路；
　　 本研究首次報道了骨肉瘤的腫瘤干細胞可來源于分化的成骨細胞，并進一步從印跡基因角度探討了TSSC3參與骨肉