HA表位標記的azurin基因真核表達載體的構建及其轉染人骨肉瘤U2OS細胞的實驗研究.pdf

1、研究背景骨肉瘤(osteosarcoma)是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，轉移發(fā)生早，預后差。目前臨床上對骨肉瘤的治療多采用手術、化療等綜合治療，使得患者的五年生存率較以前顯著提高。大劑量化療帶來的嚴重副反應以及多藥耐藥等問題使得骨肉瘤的治療難以完全治愈。最近，使用活致病菌、減毒致病菌或致病菌的純化產物用于腫瘤治療是研究熱點之一。 微生物病原體感染能引起人類和動物體內惡性腫瘤的退變，但活菌因其產生明顯的毒性和副作用限制了其在人類

2、腫瘤治療中的應用。因此，目前傾向于尋找具有抗腫瘤作用的致病菌的純代謝產物用于癌癥治療。azurin就是近年發(fā)現(xiàn)的一種很有前途的抗腫瘤生物蛋白之一。 azurin最初是從銅綠假單胞菌分泌的一種參與細胞氧化還原反應中的電子傳遞作用的蘭銅蛋白，近期的研究證實azurin在體外和荷瘤裸鼠體內可選擇性的誘導某些黑色素瘤和人乳腺癌等腫瘤細胞凋亡，同時發(fā)現(xiàn)azurin在體內誘導腫瘤細胞凋亡時，對機體無毒副作用。我們課題組已構建了包含azuri

3、n全長DNA的pqe30/azurin載體，獲得了能表達azurin的工程活菌M15，純化出有活性的azurin，前期研究還發(fā)現(xiàn)azurin在體外能選擇性的誘導人骨肉瘤U2OS細胞凋亡，但目前采用工程活菌M15并不能獲得大量的、有活性的、純化azurin用于臨床的長期治療。因此本研究首次將azurin基因構建到真核表達載體pcDNA3.1(+)，并將該真核表達載體導入人骨肉瘤U2OS細胞，使azurin蛋白在人骨肉瘤U2OS細胞中得到有

4、效表達，進一步研究azurin在骨肉瘤基因治療中的作用。 研究目的1.應用定向克隆z技術構建帶有流感病毒血凝素9肽表位標簽(HAtag)標記的azurincDNA基因真核表達載體pcDNA3.1(+)/azurin，酶切鑒定和測序。2.采用脂質體基因轉染技術，將真核表達質粒pcDNA3.1(+)/azurin瞬時轉染體外培養(yǎng)的人骨肉瘤U2OS細胞。檢測pcDNA3.1(+)/azurin基因轉染是否具有促進人骨肉瘤U2OS細胞凋

5、亡的生物學活性；檢測人骨肉瘤U2OS細胞所分泌的azurin在誘導骨肉瘤細胞凋亡時bcl-2、bax、bcl-xl、p53和Survivin等凋亡相關基因的變化，探討azurin誘導骨肉瘤細胞凋亡的分子機制。 研究方法本課題的實驗分兩部分。 第一部分的實驗，通過PCR擴增獲得流感病毒血凝素9肽表位標簽(HAtag)標記的的azurincDNA片斷，應用定向克隆技術將該DNA片斷裝入真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構

6、建帶有血凝素抗原標記肽(HA)的azurincDNA基因真核表達質粒pcDNA3.1(+)/azurin，酶切鑒定和測序。 第二部分的實驗，采用LipofectAMINE2000基因轉染技術將該真核表達載體瞬時轉染體外培養(yǎng)的人骨肉瘤U2OS細胞；RT-PCR檢測轉染陽性質粒的人骨肉瘤U2OS細胞azurinmRNA、Westernblot檢測轉染陽性質粒的人骨肉瘤U2OS細胞表達azurin蛋白；流式細胞術檢測轉染陽性質粒的人骨

7、肉瘤U2OS細胞所分泌的azurin對人骨肉瘤U2OS細胞凋亡的促進作用；瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細胞典型梯狀電泳帶；半定量RT-PCR檢測azurin在誘導骨肉瘤細胞凋亡時bcl-2、bax、bcl-xl、p53和Survivin等凋亡相關基因的變化。 研究結果1.經酶切鑒定和測序證實所構建的真核表達質粒pcDNA3.1(+)/azurin堿基序列和閱讀框架正確。 2.采用LipofectAMINE2000基因轉染技術將

8、真核表達質粒pcDNA3.1(+)/azurin瞬時轉染人骨肉瘤U2OS細胞72小時后。 1)轉染細胞的RT-PCR分析結果顯示：pcDNA3.1(+)/azurin轉染人骨肉瘤U2OS細胞后獲得了約414bp的目的條帶。 2)Westemblot檢測結果顯示：瞬時轉染pcDNA3.1(+)/azurin的人骨肉瘤U2OS細胞中有azurin-HA的表達，說明轉染細胞能表達azurin。 3)流式細胞術檢測結果顯

9、示：與空白組和對照組相比，轉染有azurin基因的人骨肉瘤U2OS細胞，其G0/G1期細胞減少明顯，S期和G2/M期細胞也減少；轉染組的凋亡率為64.30％±13.12％，明顯高于空白組的10.16％±1.87％和對照組的16.42％±7.19％，差異有意義，說明轉染細胞分泌的azurin能有效促進人骨肉瘤U2OS細胞凋亡。 4)瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示：轉染pcDNA3.1(+)/azurin的細胞呈現(xiàn)凋亡細胞典型梯狀電泳帶

10、，而在空白組、對照組均呈現(xiàn)單一電泳帶。 5)半定量RT-PCR檢測結果顯示：轉染細胞分泌的azurin在有效促進人骨肉瘤U2OS細胞凋亡時，促凋亡相關基因baxmRNA水平明顯高于對照組和空白組，bax/β-actin光密度比值在轉染組、對照組和空白組分別為0.45、0.22和0.13；促凋亡相關基因p53mRNA水平也明顯高于對照組和空白組，p53/β-actin光密度比值在轉染組、對照組和空白組分別為0.3、0.2和0.12

11、；抑凋亡相關基因bcl-2mRNA水平明顯低于對照組和空白組，bcl-2/β-actin光密度比值在轉染組、對照組和空白組分別為0.26、0.41和1.02；凋亡相關基因bcl-xlmRNA、SurvivinmRNA水平在各組基本一致。 結論1.實驗得到的含azurin基因的真核表達質粒pcDNA3.1(+)/azurin經酶切鑒定和測序證實：堿基序列和閱讀框架正確。 2.本實驗成功地將真核表達質粒pcDNA3.1(+)