熒光定量PCR檢測(cè)急性髓細(xì)胞白血病FLT3基因表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、研究背景： 急性白血病是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。骨髓中異常的白血病細(xì)胞大量增殖并侵潤(rùn)各種器官、組織，正常造血受抑制。 急性髓細(xì)胞白血病(AML)具有高度異質(zhì)性。因此，需要對(duì)AML生物學(xué)特征更好的理解，分子特征更好的界定，病理發(fā)病機(jī)制更好的闡明，從而更好的區(qū)分AML的亞群，探索包括靶向治療在內(nèi)的新的治療措施，才能使療效得到進(jìn)一步改善。 AML中的一些特定染色體異常，如t(15,17)，t(8,21)，in

2、v(16)/t(16；16)，t(11q23)，del(5q)，-7，3q等的發(fā)生率及意義已經(jīng)明確。目前AML亞群最有意義的分類就是根據(jù)白血病細(xì)胞的這些核型異常確定其危險(xiǎn)度。由此所確立的三個(gè)細(xì)胞遺傳學(xué)分組(高危組，中危組，低危組)被廣泛接受并用于臨床。但這種分型也有其局限性，它將無(wú)特定染色體異?；颊呷繗w入中危組，而此組病人占所有AML50％左右，包含不同臨床特征和預(yù)后，只有進(jìn)一步對(duì)這部分病人進(jìn)行精細(xì)分群，才有可能制定分層治療，以進(jìn)一步

3、提高療效。因此，有必要深入研究正常核型AML預(yù)后相關(guān)的基因異常。 FLT3基因主要表達(dá)于造血干細(xì)胞以及腦、胎盤和肝臟，在骨髓中限制性表達(dá)于CD34+細(xì)胞。在骨髓中，由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的FLT3配體(FL)以膜結(jié)合型和可溶型的方式，和FLT3相互作用，單獨(dú)或聯(lián)合其他細(xì)胞因子，刺激造血干細(xì)胞。這種FLT3及FL的相互作用，在造血干細(xì)胞的自我更新、增殖、分化方面起到關(guān)鍵性作用。 約20％～25％AML病例存在FLT3基因近膜區(qū)序列

4、內(nèi)部串連重復(fù)(internaltandemduplications，ITD)，稱為FLT3/ITD突變。此外，還有約7％的AML病例存在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)區(qū)點(diǎn)突變，通常發(fā)生在835或836密碼子，稱為FLT3/TKD突變。大部分研究認(rèn)為FLT3/TKD突變與AML預(yù)后無(wú)關(guān)，而FLT3/ITD突變與AML發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)，是一個(gè)重要的獨(dú)立預(yù)后因素。幾項(xiàng)大規(guī)模的研究證實(shí)，F(xiàn)LT/ITD突變對(duì)AML的影響主要體現(xiàn)在長(zhǎng)期預(yù)后上，大多數(shù)研究報(bào)道，F(xiàn)

5、LT3/ITD突變意味著更短的總生存期(overallsurvival，OS)、無(wú)病生存期(disease-freesurvival，DFS)、無(wú)事件存活期(event-freesurvival，EFS)和更高的累計(jì)復(fù)發(fā)率(Cumulativerelapserate，CRR)。并且FLT3/ITD突變后其酪氨酶激酶活性增強(qiáng)，可導(dǎo)致自發(fā)激活，引起RAS和STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，是促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖及AML的進(jìn)展的主要原因之一?，F(xiàn)已有F

6、LT3抑制劑投入Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗(yàn)，其單用或聯(lián)合化療治療FLT3/ITD突變AML已經(jīng)取得了肯定的臨床療效。 FLT3基因突變已得到廣泛深入的研究，但與此對(duì)應(yīng)的是關(guān)于FLT3基因表達(dá)水平與急性白血病的關(guān)系還知之甚少。考慮到野生型FLT3在正常骨髓中調(diào)節(jié)分化和凋亡的作用，以及在白血病患者中的異常的高表達(dá)率，因此有必要深入研究其與AML發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后關(guān)系。在本研究中，我們構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FLT3mRNA表達(dá)量的方法，并檢

7、測(cè)69例初發(fā)AML患者及5例健康者FLT3轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)量，對(duì)其與FLT3/ITD突變，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)，免疫表型、臨床特征及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了探討。 目的： 1、構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FLT3mRNA表達(dá)量的方法。 2、檢測(cè)初治AML患者FLT3mRNA表達(dá)水平及不同F(xiàn)AB分型表達(dá)水平的差異。 3、探討AML不同核型、臨床特征及CD34表達(dá)與FLT3mRNA表達(dá)量的關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)上述AML患者中F

8、LT3/ITD突變情況并分析其與FLT3mRNA表達(dá)量的關(guān)系。 4、探討FLT3基因表達(dá)水平對(duì)AML預(yù)后的影響及作為檢測(cè)微小殘留病變指標(biāo)的初步評(píng)價(jià)。 方法： 1.培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，提取總RNA，針對(duì)FLT3mRNA設(shè)計(jì)引物，RT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)片斷，PCR產(chǎn)物純化后轉(zhuǎn)化到T載體，構(gòu)建含目標(biāo)片段的質(zhì)粒，做為陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)模板的克隆。 2.克隆的陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)模板按106，105，104，103，102,101

9、copies/μ1梯度稀釋，在熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線并驗(yàn)證該方法的靈敏性和重復(fù)性。 3.研究對(duì)象：AML樣本取自經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)分型確診的69例初治AML患者，骨髓異常增生綜合癥(MDS)及繼發(fā)性AML均不作為入選對(duì)象。5名健康者骨髓標(biāo)本為試驗(yàn)對(duì)照組。 4.提取AML及健康者骨髓標(biāo)本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到FLT3mRN

10、A表達(dá)量，并分析其與FAB分型、核型、CD34表達(dá)、臨床特征及療效和預(yù)后關(guān)系。追蹤部分病例，觀察不同病程中FLT3表達(dá)量的變化。 5.提取AML及健康者骨髓標(biāo)本總DNA，針對(duì)FLT3基因在11號(hào)外顯子近端和12例號(hào)外顯子遠(yuǎn)端分別設(shè)計(jì)保守序列引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)FLT3/ITD突變。 6.兩組計(jì)量資料間分布比較用Mann-WhitneyUtest；兩組以上計(jì)量資料間分布比較用Kruskal-Wallistest及Bo

11、nferronitest；兩變量間相關(guān)分析采用Spearmanrankcorrelationtest；率的比較采用卡方檢驗(yàn)；生存分析采用KaplanMeieranalyses，不同生存曲線間差異采用log-ranktest。所有檢驗(yàn)以P＜0.05為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 1.利用Trizol提取的THP-1總RNA經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見(jiàn)28S和18S明顯的2條條帶，證明抽提的RNA質(zhì)量完好，無(wú)DNA污染。R

12、T-PCR擴(kuò)增后終產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，在紫外線下觀察，可看到與目的片段大小一致的約70bp的電泳條帶。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與Genebank中相應(yīng)的堿基序列相比較同源性為100％。 2.不同梯度定量模板的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)(CT值)之間，有著非常好的線性相關(guān)關(guān)系(r=0.9996)。靈敏度達(dá)10-5μg總RNA。 3.69例AML骨髓標(biāo)本中FLT3基因表達(dá)量中位數(shù)為17240copies/μgRNA(

13、273～834805)，5例健康者骨髓標(biāo)本中基因表達(dá)量中位數(shù)為2648copies/μgRNA(2349～3941)，AML組FLT3基因表達(dá)顯著高于正常骨髓組(p=0.017Mann-WhitneyUtest)。各FAB分型間FLT3基因表達(dá)量存在顯著差異(P=0.0005，Kruskal-Wallistest)，M2、M4、M5較M3顯著增高。AML中FLT3基因表達(dá)的水平與外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)存在相關(guān)性(Spearman's

14、相關(guān)系數(shù)rs=0.494，P=0.0001)，F(xiàn)LT3基因表達(dá)量的增高與WBC數(shù)目成正相關(guān)。FLT3表達(dá)量與Hb、PLT無(wú)明顯相關(guān)性。在染色體可評(píng)估的57例AML中，F(xiàn)LT3基因在各核型之間的表達(dá)存在顯著差異，伴有t(15；17)者低于t(11q23)及復(fù)雜核型者，高危核型組高于低危核型組。在有免疫表型結(jié)果的65例AML中，流式檢測(cè)骨髓白血病細(xì)胞CD34陰性及陽(yáng)性病例之間FLT3基因表達(dá)無(wú)顯著性差異。 4.69例AML患者FLT

15、3/ITD突變陽(yáng)性17例(24.6％)。5例健康者FLT3/ITD突變檢測(cè)均為陰性。FLT3/ITD突變陰性組及陽(yáng)性組FLT3基因表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P=0.205)。 5.49例可隨訪AML中患者中FLT3基因高表達(dá)病例化療后CR率與低表達(dá)病例CR率相比無(wú)顯著性差異(P=0.425)；而在正常核型AML病例中，F(xiàn)LT3基因高表達(dá)病例顯示出了CR率低于低表達(dá)病例的趨勢(shì)(P=0.062)。在誘導(dǎo)治療后中位數(shù)為124天(67～21

16、0天)的隨訪期內(nèi)，F(xiàn)LT3基因高表達(dá)病例與低表達(dá)病例的累計(jì)復(fù)發(fā)率(CRR)無(wú)顯著性差異(P=0.631)；但在在正常核型組中，F(xiàn)LT3基因高表達(dá)病例的CRR有高于低表達(dá)病例的明顯趨勢(shì)(P=0.102)。此外，生存曲線圖顯示出正常核型病例中FLT3基因高表達(dá)者有OS不利的趨勢(shì)。 6.5例患者在疾病進(jìn)程的不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)FLT3的表達(dá)量顯示：3例長(zhǎng)期緩解病例在取得CR后FLT3基因表達(dá)量進(jìn)行性降低，在緩解期始終處于一個(gè)較低水平，而

17、兩例復(fù)發(fā)FLT3基因均表現(xiàn)出在疾病初發(fā)時(shí)高表達(dá)，CR后水平降低，復(fù)發(fā)時(shí)又升高的現(xiàn)象。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FLT3mRNA表達(dá)水平的方法。 2.AML患者FLT3基因表達(dá)水平在AML中顯著高于正常人群，與外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)存在正相關(guān)；在AML各FAB分型及不同染色體核型中存在差異；M2、M4、M5型FLT3基因表達(dá)水平顯著高于M3型；預(yù)后良好核型其表達(dá)量較低，而在預(yù)后差核型患者中表達(dá)量顯著升