香煙提取物與轉(zhuǎn)化生長因子-β1對慢阻肺氣道平滑肌細胞的影響研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(COPD),又稱“慢阻肺”是一種以呼吸道氣流阻塞為特點的呼吸道疾病,病情常呈進行性發(fā)展[1]。持續(xù)且大量增長的COPD發(fā)病率和死亡率已造成了沉重的社會負擔(dān)和經(jīng)濟負擔(dān)。COPD患者肺部的主要病癥是呼吸道持續(xù)性炎癥和不可逆的氣流阻塞[1]。小氣道氣道重塑被認為是造成氣道氣流受限的重要原因。小氣道重塑表現(xiàn)為粘膜增厚,基底膜增厚以及細胞外基質(zhì)蛋白過度沉積,在重癥 COPD患者中還觀察到氣道平滑肌(ASM)組織增生。細胞外基質(zhì)(

2、ECM)是一個由生物大分子和蛋白水解酶相互作用而構(gòu)成的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),為細胞與細胞,細胞與基質(zhì)之間相互作用提供平臺。在肺部,細胞外基質(zhì)的組成成分影響著動態(tài)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能。通過組織染色等研究發(fā)現(xiàn),COPD患者氣道細胞外基質(zhì)的成分明顯發(fā)生改變。目前認為,吸煙是導(dǎo)致COPD發(fā)生發(fā)展的主要原因,許多研究認為COPD的典型發(fā)病原因是因為吸煙引起慢性炎癥從而致使組織破壞,然而有研究表明, COPD患者氣道重塑可獨立于氣道炎癥而產(chǎn)生。研究顯示,CO

3、PD患者的成纖維細胞在受到香煙提取物(CSE)的刺激之后可提高成粘連蛋白(Fibronectin, FN)和基底膜聚糖(Perlecan)的沉積量,而降低核心蛋白聚糖(Decorin)和雙糖鏈蛋白多糖(Biglycan)等蛋白聚糖的沉積。然而目前關(guān)于香煙對COPD氣道平滑肌細胞影響的研究卻較少。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor, TGF-β1)是一種促纖維化細胞因子,常常在急性或者慢性肺部疾病中表

4、達增高,如COPD、哮喘和肺纖維化等。TGF-β1被認為在組織纖維化的病理過程中扮演著重要的作用,可刺激多種細胞外基質(zhì)蛋白的表達與分泌如纖連蛋白、基底膜蛋白和多種膠原蛋白。扣針蛋白-1(Fibulin-1, FBLN-1)是一種分泌型糖蛋白,它與細胞外基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的形成和再建密切相關(guān),與多種細胞外基質(zhì)蛋白相互作用如纖連蛋白、巢蛋白以及層黏粘蛋白等。然而目前對于FBLN-1在氣道纖維化的病理機制中所起到的作用還不清楚。
　　本研究假設(shè)來

5、自COPD患者與非COPD患者的氣道平滑肌細胞在CSE或TGF-β1單獨作用下,其細胞外基質(zhì)基因表達趨勢會明顯不同,并且氣道平滑肌細胞會對CSE和 TGF-β1這兩種刺激物產(chǎn)生明顯不同的細胞外基質(zhì)基因表達趨勢。進一步,我們假設(shè)兩個實驗組的平滑肌細胞對氣道重塑相關(guān)蛋白的表達和釋放也不相同,并且對CSE刺激產(chǎn)生的細胞行為的反應(yīng)也不相同。最后我們假設(shè) TGF-β1可促進 FBLN-1在細胞外基質(zhì)中的沉積,并且在COPD氣道平滑肌細胞中的表達量

6、更高。為檢驗以上假設(shè),我們采用導(dǎo)致COPD產(chǎn)生的高危因素-香煙提取物(CSE),以及氣道纖維化誘導(dǎo)因子 TGF-β1作為刺激物,對體外培養(yǎng)的來自 COPD患者與非 COPD患者的氣道平滑肌細胞進行了刺激。繼而,檢測與觀察了相應(yīng)的氣道平滑肌細胞細胞外基質(zhì)蛋白基因和細胞粘附相關(guān)基因的表達水平。在此基礎(chǔ)上,進一步篩選并檢測了部分膠原蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)的表達情況,并檢測了CSE對氣

7、道平滑肌細胞粘附和修復(fù)功能的影響。最后,我們深入探究了FBLN-1在氣道纖維化中可能起到的作用。
　　本研究表明：⑴CSE比TGF-β1上調(diào)更多細胞外基質(zhì)蛋白基因和與細胞粘附相關(guān)的基因,特別是在COPD組尤為明顯。使用濃度為5％的CSE或 TGF-β1刺激氣道平滑肌細胞之后,膠原蛋白類基因在COPD組中上調(diào)數(shù)量高于非COPD組;而MMP類基因在非COPD組中上調(diào)數(shù)量高于COPD組。10％的CSE使COPD組氣道平滑肌細胞比非COP

8、D組上調(diào)更多MMP基因。TGF-β1比5％的CSE上調(diào)更高倍數(shù)的COPD膠原蛋白基因;而5％的CSE比 TGF-β1上調(diào)更高倍數(shù)和數(shù)量的非 COPD的MMP基因。⑵MMP在培養(yǎng)基上清液中的總表達檢測結(jié)果顯示,基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)在氣道平滑肌細胞中的表達量相對于基質(zhì)金屬蛋白酶-1、-3、-10(MMP-1,-3,-10)更高,但是 CSE和 TGF-β1對其表達量沒有影響。MMP-3和MMP-10的表達趨勢類似,高濃度的CSE

9、(10％)可增高氣道平滑肌細胞中MMP-3和MMP-10的表達量,而TGF-β1僅增高COPD氣道平滑肌細胞中MMP-3和MMP-10的表達量。CSE而非TGF-β1增高了MMP-1的表達量,并且兩個實驗組細胞受CSE刺激之后其MMP-1表達量有顯著性差異。⑶CSE或TGF-β1的刺激僅僅增高了COPD氣道平滑肌細胞的膠原蛋白-8α1(Collagen VIIIα1, COL8A1)在細胞外基質(zhì)中的沉積。氣道組織染色實驗進一步證實 CO

10、PD患者氣道內(nèi) COL8A1比非 COPD患者氣道內(nèi) COL8A1的表達量更高。⑷CSE僅僅降低 COPD氣道平滑肌細胞的粘附和傷口修復(fù)能力,對非COPD氣道平滑肌細胞沒有影響,然而 TGF-β1促進 COPD氣道平滑肌細胞的粘附能力。⑸TGF-β1降低氣道平滑肌細胞分泌可溶型 FBLN-1而增高細胞外基質(zhì)中沉積的FBLN-1。TGF-β1可促進外源性FBLN-1沉積于細胞外基質(zhì)之中。
　　本研究揭示了COL8A1在COPD與非C

11、OPD氣道平滑肌組織中的差異和在氣道平滑肌細胞中的表達差異,從而為進一步探究COL8A1在氣道重塑中的作用提供了理論依據(jù)。本課題的研究也顯示 CSE可誘導(dǎo)多種MMP基因表達增高,特別是MMP-1(膠原蛋白酶)在COPD氣道平滑肌細胞中表達顯著高于非 COPD氣道平滑肌細胞,此實驗結(jié)果提示 MMP在肺泡組織降解中起到重要作用。在TGF-β1的誘導(dǎo)下,可溶型 FBLN-1向細胞外基質(zhì)FBLN-1轉(zhuǎn)化,為我們理解細胞外基質(zhì)沉積在氣道纖維化中的