壓力對共培養(yǎng)上皮細(xì)胞下的氣道平滑肌細(xì)胞影響的研究.pdf

1、氣道是連接咽和肺之間的呼氣和吸氣的通道，主要由氣道上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肥大細(xì)胞等組成。氣道的有節(jié)律性的收縮，可以保證呼吸作用的正常進(jìn)行。當(dāng)哮喘發(fā)生時(shí)，會(huì)使氣道壁頻繁痙攣，呼吸困難。哮喘的反復(fù)發(fā)作會(huì)引起氣道壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化：氣道平滑肌增殖和變厚、細(xì)胞外基質(zhì)沉淀等，導(dǎo)致氣流阻塞以及非特異性的氣道高反應(yīng)性[1-2]。
　　 哮喘病現(xiàn)在仍然是一個(gè)亟待解決的世界性難題，目前我們對哮喘病的發(fā)病機(jī)理還存在著爭議，還需要我們做

2、更多的基礎(chǔ)性研究來更深層次的了解哮喘病。在本課題研究中，我們基于哮喘病患者的氣道平滑肌增厚和收縮能力下降這些癥狀，模擬身體內(nèi)的力學(xué)環(huán)境，研究正常的氣道平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞在受到外來壓力刺激的時(shí)候，是否這些正常的平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生改變。
　　 上皮細(xì)胞位于氣道的最外層，在它的下面是平滑肌細(xì)胞。當(dāng)上皮細(xì)胞受到刺激后，可以分泌一些細(xì)胞因子。這些細(xì)胞因子擴(kuò)散到平滑肌細(xì)胞上面以后，會(huì)引起平滑肌細(xì)胞的某些生物學(xué)特性的改變。我們的主

3、要工作就是設(shè)計(jì)一個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)模型，把上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)在一起，然后對這個(gè)系統(tǒng)施加壓力，最后檢測平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)特性是否改變。主要研究工作和結(jié)果如下：
　　 ①大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（SMC）、上皮細(xì)胞(RTE)的原代培養(yǎng)和鑒定利用組織貼塊法對大鼠氣道平滑肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用胰蛋白酶消化法對上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。經(jīng)過摸索，組織貼塊法能夠獲得純度很高的平滑肌細(xì)胞。在無菌環(huán)境下解剖大鼠，將獲得的氣管剪成小塊，平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中

4、，用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)六天左右，可見有細(xì)胞爬出來，呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特有的外觀。同樣，利用氣管灌注法，0.05％的胰蛋白酶能夠消化得到很多上皮細(xì)胞，經(jīng)過一些純化處理以后，即可以得到純度較高的上皮細(xì)胞。等到兩種細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部80％左右時(shí)，即可以用0.25％的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。
　　 將兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定。首先，在形態(tài)學(xué)上，兩種細(xì)胞的符合各自的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)。然后對平滑肌細(xì)胞特異的α-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行免疫熒光染色，得出結(jié)論所獲得

5、的確實(shí)是平滑肌細(xì)胞。再根據(jù)上皮細(xì)胞特征性地表達(dá)角蛋白，利用細(xì)胞免疫組化（SABC）法，可以判定成功獲得上皮細(xì)胞。
　　 ②受力情況下與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的氣道平滑肌的增殖本課題中，利用MTT法，對四種不同培養(yǎng)情況下的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行增殖測定，最后繪制出不同培養(yǎng)條件下的氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）的生長曲線。結(jié)果顯示：與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，并且受到壓力刺激的情況下，平滑肌細(xì)胞增殖速度要比其他培養(yǎng)條件要更快一些。并且通過對比分析，說明在壓力條

6、件下，上皮細(xì)胞會(huì)分泌一些細(xì)胞因子，這些因子與平滑肌細(xì)胞結(jié)合，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖。
　　 ③受力情況下與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的氣道平滑肌的剛度本課題中，利用原子力顯微鏡（AFM），對四種不同培養(yǎng)情況下的平滑肌細(xì)胞的楊氏模量（即剛度）進(jìn)行測定，通過比較，得到下面結(jié)果：和其他幾種培養(yǎng)條件相比，與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，并且受到壓力刺激的情況下，平滑肌細(xì)胞的剛度要明顯變大。這可以說明，通過共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬氣道，對其施加壓力，平滑肌細(xì)胞的剛度會(huì)變大，這