KLF8在調(diào)控人骨肉瘤細胞增殖和細胞侵襲中的作用.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma，os)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多發(fā)生于兒童和青少年發(fā)育時期。通過手術(shù)治療后，發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤病人的術(shù)后五年存活率普遍低于20％。骨肉瘤如果不及時治療，往往會在6至12個月內(nèi)通過血行轉(zhuǎn)移的方式發(fā)生肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，這已經(jīng)成為骨肉瘤臨床觀察中，最為顯著的特征之一，也是影響病人預(yù)后的主要因素。
　　KLF8(Krüppel-like factor8)是KLF轉(zhuǎn)錄因子家族第一亞群的一員。KLF家族在N末端均

2、具有三個高度保守的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)，可以特異結(jié)合富含GC的啟動子區(qū)。KLF轉(zhuǎn)錄因子在人類生長發(fā)育以及各種疾病包括腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。KLF8被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細胞中高表達。KLF8是調(diào)控細胞周期的重要轉(zhuǎn)錄因子，其在致癌性轉(zhuǎn)化(oncogenic transformation)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)中具有關(guān)鍵作用。雖然關(guān)于KLF8在腫瘤中的功能已有不

3、少的研究，但KLF8在人骨肉瘤中的功能還未見詳盡報道。本研究的目的就是探討KLF8在Saos-2骨肉瘤細胞中尤其是細胞侵襲中的生物學作用。
　　首先通過RT-PCR(real-time PCR)和western blotting實驗，發(fā)現(xiàn)KLF8在骨肉瘤細胞系中的表達遠遠高于正常成骨細胞中的表達，且惡性越高、侵襲性越強的細胞，KLF8的表達量越高。同時對骨肉瘤病理組織的檢測發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤原發(fā)灶KLF8表達高于癌旁組織,但低于肺轉(zhuǎn)移灶

4、。通過構(gòu)建沉默KLF8基因表達的shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染入Saos-2細胞，以隨機合成的shRNA作為陰性對照，QRT-PCR及WB檢測發(fā)現(xiàn)在高惡性骨肉瘤細胞系Saos-2細胞中成功沉默了KLF8基因的表達，顯著下調(diào)了KLF8的mRNA和蛋白水平。
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達KLF8-shRNA的Saos-2細胞，分析了KLF8基因的沉默對骨肉瘤細胞系生長增殖的影響。首先用MTT方法測定細胞增殖情況。同陰性對照細胞相比，shRNA-KLF8

5、組的細胞數(shù)明顯少于陰性對照細胞，說明KLF8的沉默抑制了細胞的增殖。平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)KLF8表達降低的細胞形成克隆數(shù)明顯少于對照細胞，說明KLF8影響了細胞的群體依賴性和克隆形成能力。流式細胞術(shù)對細胞周期和細胞凋亡進行分析發(fā)現(xiàn)KLF8的沉默使骨肉瘤細胞在G0/G1期停滯，且細胞凋亡率顯著提高。說明KLF8對細胞增殖的影響是通過使細胞周期停滯和增加細胞凋亡兩方面來完成的。
　　通過Transwell@細胞侵襲