在線固相萃取技術(shù)在高通量藥物代謝分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、藥物代謝動力學(xué)旨在通過測定生物樣本中的藥物或者代謝產(chǎn)物的濃度，定量描述藥物進(jìn)入體內(nèi)以后的吸收、分布、代謝、排泄過程，進(jìn)而闡明藥物的藥效或者毒性，為新藥研究的代謝篩選和臨床用藥的療效評價提供重要依據(jù)。面對不斷涌現(xiàn)的大量候選藥物，在進(jìn)行藥效學(xué)研究的同時，需要進(jìn)行藥代動力學(xué)評價，這就要求建立并優(yōu)化相關(guān)分析方法對生物樣品中的目標(biāo)成分（藥物、代謝產(chǎn)物、其他外源性成分）進(jìn)行高靈敏度、快速準(zhǔn)確的定量分析。基于在線固相萃取技術(shù)的高通量前處理技術(shù)和常規(guī)分

2、析短柱的快速分析測定方法，本文構(gòu)建了“準(zhǔn)確、靈敏、簡便、高通量”的分析策略，并將其應(yīng)用到新藥藥代動力學(xué)研究中。
　　 一、在線固相萃取技術(shù)及分析短柱在藥代動力學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展
　　 臨床前藥代動力學(xué)研究包括動物實驗、方法學(xué)考察和驗證、樣品前處理、樣品分析、數(shù)據(jù)處理5個方面，其中大部分和分析方法的建立與應(yīng)用緊密相連。現(xiàn)代分析科學(xué)在藥代動力學(xué)研究中體現(xiàn)出舉足輕重的地位，只有建立可靠、專一、靈敏、快速的生物樣品分析方法，才能夠?qū)?/p>

3、現(xiàn)高通量生物樣品分析過程，滿足藥代動力學(xué)研究大樣本量的要求。本文對在線固相萃取技術(shù)的應(yīng)用以及基于常規(guī)分析短柱的快速分析方法的建立進(jìn)行了綜述。詳細(xì)介紹了在線固相萃取技術(shù)的特點(diǎn)，并且對其在藥物分析及生物樣品測定中的應(yīng)用進(jìn)行了一些回顧。對于在生物樣品高通量分析中也會經(jīng)常使用的分析短柱，本文對其特點(diǎn)、優(yōu)勢以及使用注意事項等進(jìn)行了討論。根據(jù)本實驗研究結(jié)果認(rèn)為采用在線固相萃取技術(shù)結(jié)合分析短柱可以有效提高樣品前處理及分析過程中的通量，從而獲得準(zhǔn)確、靈

4、敏、簡便、高通量的生物樣品分析方法。
　　 二、在線固相萃取技術(shù)結(jié)合分析短柱在藥代動力學(xué)中的應(yīng)用研究
　　 本文建立了快速測定人血漿和尿液中法羅培南以及Beagle犬血漿中硫酸氫頭孢地尼鈉的在線固相萃取-高效液相色譜法，考察了富集柱、富集流動相、切換時間等對在線固相萃取前處理系統(tǒng)的影響，研究了分析短柱在進(jìn)行生物樣品分析時分析柱型號、流動相組成、緩沖液pH值以及流速等對目標(biāo)成分保留性質(zhì)的影響。在此基礎(chǔ)上將方法成功應(yīng)用于人血

5、漿和尿液中法羅培南以及Beagle犬血漿中硫酸氫頭孢地尼鈉的藥代動力學(xué)研究中。
　　 1、針對人血漿中的法羅培南，在線固相萃取采用本教研室自行填制的富集柱，LichrospherC18，25μm，37mm×4.6mm i.d；分析柱為月旭公司UltimteTMC18，5μm，50mm×4.6mm i.d（Welth，美國）色譜柱。富集流動相為20mM的磷酸二氫鈉緩沖溶液（磷酸調(diào)pH至3.5），使用前經(jīng)過0.45μm的微孔濾膜過濾

6、，流速為2 ml/mim；分析流動相為乙腈-20mM的磷酸二氫鈉緩沖溶液（磷酸調(diào)pH至3.5）=16:84，使用前經(jīng)過0.45μm的微孔濾膜過濾，流速為1.5ml/min；兩柱柱溫均為30℃，進(jìn)樣量是100μl，紫外檢測波長為318nm。為了延長富集柱的使用壽命，采用了預(yù)先蛋白沉淀法作為保護(hù)措施。100μl血漿樣品用6％高氯酸進(jìn)行蛋白沉淀后再進(jìn)入富集柱進(jìn)行前處理，結(jié)果顯示法羅培南和內(nèi)標(biāo)加替沙星的保留時間分別為3.3和4.2min，生物樣

7、品內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)成分的測定，每個樣品分析周期為5min。與以往方法相比，此法在常規(guī)液相色譜分析法的基礎(chǔ)上提高了樣品分析速度，檢測靈敏度也得到了提高。
　　 針對人尿液中的法羅培南，在線固相萃取前處理部分以及樣品分析部分均與分析人血漿中的法羅培南一致。為了延長富集柱的使用壽命，采用了預(yù)先稀釋離心法作為保護(hù)措施。50μl尿液樣品離心稀釋后再進(jìn)入富集柱進(jìn)行前處理，結(jié)果顯示法羅培南和內(nèi)標(biāo)加替沙星的保留時間分別為3.3和4.2min

8、，生物樣品內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)成分的測定，每個樣品分析周期為5min。與以往方法相比，該方法在常規(guī)液相色譜分析法的基礎(chǔ)上提高了樣品分析通量，而且檢測靈敏度也得到了提高。
　　 2、針對新藥硫酸氫頭孢地尼鈉的臨床前藥代動力學(xué)研究的要求，實驗設(shè)計分為兩部分：（1）Beagle犬單劑量口服給藥硫酸氫頭孢地尼鈉膠囊和不同劑量市售頭孢地尼膠囊進(jìn)行藥代動力學(xué)研究以及高劑量頭孢地尼暴露水平的安全性研究；（2）Beagle犬靜脈注射給藥頭孢地尼

9、注射液（臨用前新配，將頭孢地尼標(biāo)準(zhǔn)對照品用pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液溶解即得），按10mg/犬劑量在Beagle犬后肢靜脈注射給藥，進(jìn)行絕對生物利用度研究。給藥方法：（1）試驗采用自身對照、隨機(jī)交叉試驗方法，選擇三制劑三周期的3×3拉丁方設(shè)計，即6條成年、健康Beagle犬隨機(jī)分成三組，每組2條，即硫酸氫頭孢地尼鈉膠囊（A藥）受試組、頭孢地尼膠囊（B藥）對照組、高劑量頭孢地尼（C藥）暴露組。對照組口服給藥頭孢地尼膠囊100mg/犬，受

10、試組口服給藥硫酸氫頭孢地尼鈉膠囊100mg/犬（以有效成分頭孢地尼計），暴露組口服給藥頭孢地尼膠囊300mg/犬（高劑量頭孢地尼給藥選擇以臨床3倍常規(guī)劑量計）。（2）選擇6條成年、健康Beagle犬，于后肢靜脈注射給藥頭孢地尼10mg/犬。給藥后于不同時間點(diǎn)取血，測定血漿中頭孢地尼的濃度，根據(jù)所得的血漿藥物濃度-時間曲線，采用非房室模型分別估算藥代動力學(xué)參數(shù)，并采用方差分析和雙單側(cè)t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，為下一步的臨床研究提供參考依據(jù)。

11、r>　　 對新藥硫酸氫頭孢地尼鈉的分析，在線固相萃取采用本教研室自行填制的富集柱，LichrospherC18，25μm，37mm×4.6mm i.d；分析柱為月旭公司UltimteTM C18，5μm，50mm×4.6mm i.d（Welth，美國）色譜柱。富集流動相為20mM的磷酸二氫鉀緩沖溶液（磷酸調(diào)pH至3.0），使用前經(jīng)過0.45μm的微孔濾膜過濾，流速為2ml/min；分析流動相為甲醇-乙腈-20mM的磷酸二氫鉀緩沖溶液（

12、磷酸調(diào)pH至3.0）=11.25:6.75:82，使用前經(jīng)過0.45μm的微孔濾膜過濾，流速為1.5ml/mim；兩柱柱溫均為30℃，進(jìn)樣量是100μl，紫外檢測波長為286nm。為了延長富集柱的使用壽命，采用了預(yù)先蛋白沉淀法作為保護(hù)措施。50μl血漿樣品用6％高氯酸進(jìn)行蛋白沉淀后再進(jìn)入富集柱進(jìn)行前處理，結(jié)果顯示頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)諾氟沙星的保留時間分別為2.3和3.3min，生物樣品內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)成分的測定，每個樣品分析周期為4min