面神經(jīng)缺損修復及神經(jīng)周瘢痕預防的相關研究.pdf

1、第一部分:殼聚糖導管預防周圍神經(jīng)瘢痕的實驗研究
　　實驗一:殼聚糖導管預防兔面神經(jīng)周瘢痕的實驗研究
　　目的:周圍神經(jīng)解剖性損傷后,神經(jīng)周瘢痕的形成會壓迫神經(jīng),阻礙軸突的再生,影響神經(jīng)功能的恢復。應用可生物降解的殼聚糖導管作為物理屏障,觀察其對兔面神經(jīng)周瘢痕及神經(jīng)內(nèi)血運的影響。
　　方法:新西蘭大白兔36只,行腮腺大部切除,面神經(jīng)解剖性損傷造模。隨機分為覆蓋組、包裹組、自體對照組。于術后4、12周采用Petersen分

2、級評估面神經(jīng)與周圍組織粘連情況,采用組織學染色方法檢測面神經(jīng)周瘢痕及神經(jīng)內(nèi)血管密度,并采用觸須運動、透射電鏡、神經(jīng)電生理等方法對面神經(jīng)功能進行評估。
　　結果:術后4周時petersen評分無明顯差異(P>0.05),12周時瘢痕粘連較明顯,覆蓋組與包裹組解剖時較自體對照組容易(P<0.01);術后4周覆蓋組有髓神經(jīng)纖維直徑、髓鞘厚度、神經(jīng)纖維數(shù)量均優(yōu)于包裹組及對照組,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05);術后4、12周對照組膠原厚度大

3、于覆蓋組與包裹組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);術后12周覆蓋組與自體對照組兩者纖維直徑較接近,排列均整齊,髓鞘壁較厚,兩組間無明顯差異(P>0.05),包裹組纖維直徑、髓鞘壁厚度、神經(jīng)內(nèi)血管密度均較小,與前兩者存在顯著性差異,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　結論:殼聚糖導管作為物理屏障覆蓋于面神經(jīng)表面可有效減少神經(jīng)周瘢痕的形成、減輕瘢痕對面神經(jīng)功能的影響。
　　實驗二:殼聚糖導管復合透明質(zhì)酸預防大鼠坐骨神經(jīng)瘢痕的

4、實驗研究
　　目的:觀察將殼聚糖導管與透明質(zhì)酸聯(lián)合應用對大鼠坐骨神經(jīng)1cm鉗夾性損傷后神經(jīng)功能的影響。
　　方法:選用清潔級健康成年SD大鼠60只,坐骨神經(jīng)鉗夾損傷造模,隨機分為覆蓋組、覆蓋+透明質(zhì)酸組、鉗夾組、鉗夾+透明質(zhì)酸組,每組15只。于術后4、8、12周對坐骨神經(jīng)與周圍組織粘連、神經(jīng)周瘢痕增生情況進行觀察,并對神經(jīng)功能進行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、組織學和神經(jīng)電生理檢測。
　　結果:術后4周時坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、pete

5、rsen評分、神經(jīng)纖維計數(shù)、髓鞘厚度、有髓神經(jīng)纖維平均直徑各組間均無明顯差異;術后8周、12周時,鉗夾+透明質(zhì)酸組其坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、petersen評分、神經(jīng)纖維計數(shù)、髓鞘厚度、有髓神經(jīng)纖維平均直徑等各項指標均優(yōu)于對照組。術后4、8、12周時神經(jīng)外膜膠原厚度檢測各組均明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01),12周時HA組神經(jīng)外膜膠原厚度要厚于殼聚糖組及殼聚糖+HA組,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。
　　結論:殼聚糖

6、導管復合透明質(zhì)酸可以促進鼠坐骨神經(jīng)鉗夾損傷的恢復,減少其神經(jīng)周瘢痕的產(chǎn)生。
　　實驗三:殼聚糖導管植入對腮腺術后面神經(jīng)功能恢復的臨床效果觀察
　　目的:觀察并比較殼聚糖導管應用于腮腺手術后對術后患者面神經(jīng)功能恢復的影響。
　　方法:75例腮腺腫瘤患者接受腮腺淺葉摘除術或腮腺全切手術,分為兩組,一組應用殼聚糖導管覆蓋面神經(jīng)總干及各分支,一組為常規(guī)手術作為對照。在手術后7天、1月、3月、6月和9月分別進行超聲檢查和血常規(guī)檢

7、查并按HB標準觀察面神經(jīng)功能。
　　結果:隨訪時間9月-50月,平均21.7月,75名患者中50名行腮腺淺葉摘除,25名行腮腺全切術,手術后不同時間的血常規(guī)檢及超聲查顯示無論是應用殼聚糖組還對照組,患者均無異常,表明殼聚糖導管植入體內(nèi)后不會引起不良反應。術后7天即刻面癱發(fā)生率殼聚糖組(29/32,90.6％),對照組(39/43,90.7%);永久性面癱發(fā)生率面癱發(fā)生率殼聚糖組(0/32,0%),對照組(2/43,4.7%)均無統(tǒng)

8、計學差異(P>0.05)。術后7天對兩組患者面神經(jīng)功能行HB評分,結果兩組患者面神經(jīng)麻痹嚴重程度無顯著性差異(P>0.05)。對患者面神經(jīng)恢復速度進行檢測,發(fā)現(xiàn)殼聚糖組神經(jīng)恢復速度快于對照組,差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　結論:殼聚糖導管具有良好的生物相容性,植入體內(nèi)無不良反應,在腮腺手術后應用殼聚糖導管覆蓋面神經(jīng)對其功能恢復有一定促進作用。
　　第二部分:GDNF基因慢病毒載體的構建、病毒的包裝及MSCs細胞的轉(zhuǎn)

9、染
　　目的:構建攜帶EGFP和GDNF的慢病毒載體,利用其轉(zhuǎn)染MSCs并對其進行鑒定,獲得可穩(wěn)定過表達GDNF的MSCs。
　　方法:通過PCR擴增,BamHI和AscI雙酶酶切目的基因片段,T4DNA連接酶連接,將目的基因GDNF插入慢病毒載體pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP,構建重組慢病毒。在lipofectamine2000介導下將構建成功的慢病毒轉(zhuǎn)染人胚腎細胞系(293T),包裝生產(chǎn)慢病毒,并測定病

10、毒滴度。將包裝好的慢病毒感染BMSCs,并對轉(zhuǎn)染的細胞行病毒轉(zhuǎn)染復數(shù)(MOI值)測定,篩選最佳感染復數(shù)。Western、RT-PCR分別檢測轉(zhuǎn)然后GDNF蛋白和mRNA的表達情況,流式細胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　結果:成功構建攜帶EGFP和GDNF的慢病毒,慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs后96小時強熒光表達,當MOI值為25時細胞熒光表達強且活性較好。Western和RT-PCR檢測證實GDNF在MSCs中成功表達,流式細胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率為94

11、.2%。
　　結論:成功將攜帶EGFP和GDNF的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs,獲得過表達GDNF基因的MSCs,為后期實驗提供基礎。
　　第三部分:脫細胞神經(jīng)復合GDNF轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細胞修復兔面神經(jīng)缺損的實驗研究
　　實驗一:周圍神經(jīng)脫細胞方法的篩選
　　目的:采用不同的方法對兔面神經(jīng)進行脫細胞處理,對脫細胞神經(jīng)組織學及體內(nèi)植入進行檢測,為面神經(jīng)脫細胞方法的選擇提供實驗依據(jù)。
　　方法:分別采用凍融法、化學法及凍

12、融+酶消化法處理兔面神經(jīng),對處理的神經(jīng)進行HE染色、掃描電鏡觀察和透射電鏡觀察其組織學結構;并將不同方法處理的神經(jīng)進行兔背部皮下植入,于2、4周處死動物,行大體觀察及組織學觀察。
　　結果:組織學觀察見化學法(Hudson法)、凍融+酶消化法處理的神經(jīng)其髓鞘清除較徹底,只有部分區(qū)域可見極少量髓鞘殘留,凍融法處理的神經(jīng)內(nèi)可見髓鞘皺縮、變形但有較多殘留。皮下埋植實驗觀察見單純凍融法處理的神經(jīng)內(nèi)淋巴細胞浸潤稍多,主要分布在神經(jīng)束周邊的基

13、底膜間隙中,Hudson法、凍融+酶消化法處理的神經(jīng)未見明顯的炎性細胞浸潤。
　　結論:凍融+酶消化法處理方法簡單、神經(jīng)支架結構保存完整,神經(jīng)內(nèi)髓鞘等抗原成分去除較徹底,是一種良好的去細胞方法,為后期實驗提供基礎。
　　實驗二:脫細胞神經(jīng)復合GDNF轉(zhuǎn)染的MSCs修復兔面神經(jīng)缺損
　　目的:以脫細胞面神經(jīng)為支架,復合GDNF轉(zhuǎn)染的MSCs修復兔面神經(jīng)多分支缺損,觀察其對面神經(jīng)再生及對面神經(jīng)元存活的作用。
　　方法

14、:新西蘭大白兔60只,面神經(jīng)解剖性損傷造模。完全隨機分為:脫細胞同種異體神經(jīng)移植組(ANA),脫細胞異體神經(jīng)+間充質(zhì)干細胞組(AN-MSCs),脫細胞異體神經(jīng)+GDNF轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細胞(AN-G-MSCs),自體神經(jīng)移植組(Control)。于術后4、12、24周時取材,對動物行大體觀察并采用觸須運動、神經(jīng)電生理等方法對面神經(jīng)功能進行評估,分別對移植神經(jīng)的近端及遠端行甲苯暗藍染色、透射電鏡觀察其再生軸突的變化。
　　結果:對面神

15、經(jīng)總干處神經(jīng)軸突形態(tài)計量學分析發(fā)現(xiàn),術后4周時脫細胞神經(jīng)移植組其神經(jīng)軸突計數(shù)、髓鞘厚度、髓鞘直徑均明顯低于其他三組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);術后12、24周時檢測發(fā)現(xiàn)各組間無明顯差異(P>0.05)。面神經(jīng)移植物遠端術后12周時面神經(jīng)各分支檢測脫細胞神經(jīng)移植與 MSCs組神經(jīng)軸突計數(shù)、髓鞘厚度、髓鞘直徑均明顯低于GDNF組與自體神經(jīng)移植組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術后24周時脫細胞神經(jīng)移植各項指標均低于其他三組。

16、r>　　結論:將脫細胞神經(jīng)與 GDNF轉(zhuǎn)染的 MSCs聯(lián)合應用可成功修復兔面神經(jīng)多分支缺損,其修復效果優(yōu)于單純應用脫細胞神經(jīng),且可以一定程度上保護面神經(jīng)元的存活。
　　實驗三:同種異體神經(jīng)移植修復面神經(jīng)缺損的長期隨訪觀察
　　目的:臨床應用脫細胞神經(jīng)移植修復面神經(jīng)缺損,并進行長期的隨訪,觀察其修復效果及安全性。
　　方法:2004年7月至2013年7月,因外傷或腮腺惡性腫瘤侵襲術中切除導致的面神經(jīng)缺損44例,最終共有3

17、5例神經(jīng)缺損修復患者完成隨訪觀察,其中自體神經(jīng)移植20例,脫細胞神經(jīng)移植15例。術后最短隨訪時間為9個月,隨訪時分別進行局部超聲檢查和血常規(guī)檢查,并按HB標準觀察面神經(jīng)功能。
　　結果:隨訪時間9月-9年,面神經(jīng)缺損長度10mm-50mm,其中術中一期缺損修復26例,二期手術移植9例,二期手術距損傷時間2天-3個月。術后隨訪時的血常規(guī)檢及超聲查均未發(fā)現(xiàn)無異常,表明脫細胞神經(jīng)植入體內(nèi)后未引起明顯的不良反應。最終自體神經(jīng)移植組與脫細胞