面神經(jīng)缺損修復(fù)及神經(jīng)周瘢痕預(yù)防的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分:殼聚糖導(dǎo)管預(yù)防周圍神經(jīng)瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)一:殼聚糖導(dǎo)管預(yù)防兔面神經(jīng)周瘢痕的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:周圍神經(jīng)解剖性損傷后,神經(jīng)周瘢痕的形成會(huì)壓迫神經(jīng),阻礙軸突的再生,影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。應(yīng)用可生物降解的殼聚糖導(dǎo)管作為物理屏障,觀察其對(duì)兔面神經(jīng)周瘢痕及神經(jīng)內(nèi)血運(yùn)的影響。
　　方法:新西蘭大白兔36只,行腮腺大部切除,面神經(jīng)解剖性損傷造模。隨機(jī)分為覆蓋組、包裹組、自體對(duì)照組。于術(shù)后4、12周采用Petersen分

2、級(jí)評(píng)估面神經(jīng)與周圍組織粘連情況,采用組織學(xué)染色方法檢測(cè)面神經(jīng)周瘢痕及神經(jīng)內(nèi)血管密度,并采用觸須運(yùn)動(dòng)、透射電鏡、神經(jīng)電生理等方法對(duì)面神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:術(shù)后4周時(shí)petersen評(píng)分無(wú)明顯差異(P>0.05),12周時(shí)瘢痕粘連較明顯,覆蓋組與包裹組解剖時(shí)較自體對(duì)照組容易(P<0.01);術(shù)后4周覆蓋組有髓神經(jīng)纖維直徑、髓鞘厚度、神經(jīng)纖維數(shù)量均優(yōu)于包裹組及對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);術(shù)后4、12周對(duì)照組膠原厚度大

3、于覆蓋組與包裹組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);術(shù)后12周覆蓋組與自體對(duì)照組兩者纖維直徑較接近,排列均整齊,髓鞘壁較厚,兩組間無(wú)明顯差異(P>0.05),包裹組纖維直徑、髓鞘壁厚度、神經(jīng)內(nèi)血管密度均較小,與前兩者存在顯著性差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論:殼聚糖導(dǎo)管作為物理屏障覆蓋于面神經(jīng)表面可有效減少神經(jīng)周瘢痕的形成、減輕瘢痕對(duì)面神經(jīng)功能的影響。
　　實(shí)驗(yàn)二:殼聚糖導(dǎo)管復(fù)合透明質(zhì)酸預(yù)防大鼠坐骨神經(jīng)瘢痕的

4、實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察將殼聚糖導(dǎo)管與透明質(zhì)酸聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)1cm鉗夾性損傷后神經(jīng)功能的影響。
　　方法:選用清潔級(jí)健康成年SD大鼠60只,坐骨神經(jīng)鉗夾損傷造模,隨機(jī)分為覆蓋組、覆蓋+透明質(zhì)酸組、鉗夾組、鉗夾+透明質(zhì)酸組,每組15只。于術(shù)后4、8、12周對(duì)坐骨神經(jīng)與周圍組織粘連、神經(jīng)周瘢痕增生情況進(jìn)行觀察,并對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、組織學(xué)和神經(jīng)電生理檢測(cè)。
　　結(jié)果:術(shù)后4周時(shí)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、pete

5、rsen評(píng)分、神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、有髓神經(jīng)纖維平均直徑各組間均無(wú)明顯差異;術(shù)后8周、12周時(shí),鉗夾+透明質(zhì)酸組其坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、petersen評(píng)分、神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、有髓神經(jīng)纖維平均直徑等各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組。術(shù)后4、8、12周時(shí)神經(jīng)外膜膠原厚度檢測(cè)各組均明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01),12周時(shí)HA組神經(jīng)外膜膠原厚度要厚于殼聚糖組及殼聚糖+HA組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論:殼聚糖

6、導(dǎo)管復(fù)合透明質(zhì)酸可以促進(jìn)鼠坐骨神經(jīng)鉗夾損傷的恢復(fù),減少其神經(jīng)周瘢痕的產(chǎn)生。
　　實(shí)驗(yàn)三:殼聚糖導(dǎo)管植入對(duì)腮腺術(shù)后面神經(jīng)功能恢復(fù)的臨床效果觀察
　　目的:觀察并比較殼聚糖導(dǎo)管應(yīng)用于腮腺手術(shù)后對(duì)術(shù)后患者面神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　方法:75例腮腺腫瘤患者接受腮腺淺葉摘除術(shù)或腮腺全切手術(shù),分為兩組,一組應(yīng)用殼聚糖導(dǎo)管覆蓋面神經(jīng)總干及各分支,一組為常規(guī)手術(shù)作為對(duì)照。在手術(shù)后7天、1月、3月、6月和9月分別進(jìn)行超聲檢查和血常規(guī)檢

7、查并按HB標(biāo)準(zhǔn)觀察面神經(jīng)功能。
　　結(jié)果:隨訪時(shí)間9月-50月,平均21.7月,75名患者中50名行腮腺淺葉摘除,25名行腮腺全切術(shù),手術(shù)后不同時(shí)間的血常規(guī)檢及超聲查顯示無(wú)論是應(yīng)用殼聚糖組還對(duì)照組,患者均無(wú)異常,表明殼聚糖導(dǎo)管植入體內(nèi)后不會(huì)引起不良反應(yīng)。術(shù)后7天即刻面癱發(fā)生率殼聚糖組(29/32,90.6％),對(duì)照組(39/43,90.7%);永久性面癱發(fā)生率面癱發(fā)生率殼聚糖組(0/32,0%),對(duì)照組(2/43,4.7%)均無(wú)統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后7天對(duì)兩組患者面神經(jīng)功能行HB評(píng)分,結(jié)果兩組患者面神經(jīng)麻痹嚴(yán)重程度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。對(duì)患者面神經(jīng)恢復(fù)速度進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)殼聚糖組神經(jīng)恢復(fù)速度快于對(duì)照組,差異有顯著性意義(P<0.01)。
　　結(jié)論:殼聚糖導(dǎo)管具有良好的生物相容性,植入體內(nèi)無(wú)不良反應(yīng),在腮腺手術(shù)后應(yīng)用殼聚糖導(dǎo)管覆蓋面神經(jīng)對(duì)其功能恢復(fù)有一定促進(jìn)作用。
　　第二部分:GDNF基因慢病毒載體的構(gòu)建、病毒的包裝及MSCs細(xì)胞的轉(zhuǎn)

9、染
　　目的:構(gòu)建攜帶EGFP和GDNF的慢病毒載體,利用其轉(zhuǎn)染MSCs并對(duì)其進(jìn)行鑒定,獲得可穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GDNF的MSCs。
　　方法:通過(guò)PCR擴(kuò)增,BamHI和AscI雙酶酶切目的基因片段,T4DNA連接酶連接,將目的基因GDNF插入慢病毒載體pLenti6.3_MCS_IRES2-EGFP,構(gòu)建重組慢病毒。在lipofectamine2000介導(dǎo)下將構(gòu)建成功的慢病毒轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系(293T),包裝生產(chǎn)慢病毒,并測(cè)定病

10、毒滴度。將包裝好的慢病毒感染BMSCs,并對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞行病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI值)測(cè)定,篩選最佳感染復(fù)數(shù)。Western、RT-PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)然后GDNF蛋白和mRNA的表達(dá)情況,流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建攜帶EGFP和GDNF的慢病毒,慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs后96小時(shí)強(qiáng)熒光表達(dá),當(dāng)MOI值為25時(shí)細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)且活性較好。Western和RT-PCR檢測(cè)證實(shí)GDNF在MSCs中成功表達(dá),流式細(xì)胞儀觀察轉(zhuǎn)染效率為94

11、.2%。
　　結(jié)論:成功將攜帶EGFP和GDNF的慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs,獲得過(guò)表達(dá)GDNF基因的MSCs,為后期實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　第三部分:脫細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合GDNF轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔面神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究
　　實(shí)驗(yàn)一:周圍神經(jīng)脫細(xì)胞方法的篩選
　　目的:采用不同的方法對(duì)兔面神經(jīng)進(jìn)行脫細(xì)胞處理,對(duì)脫細(xì)胞神經(jīng)組織學(xué)及體內(nèi)植入進(jìn)行檢測(cè),為面神經(jīng)脫細(xì)胞方法的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:分別采用凍融法、化學(xué)法及凍

12、融+酶消化法處理兔面神經(jīng),對(duì)處理的神經(jīng)進(jìn)行HE染色、掃描電鏡觀察和透射電鏡觀察其組織學(xué)結(jié)構(gòu);并將不同方法處理的神經(jīng)進(jìn)行兔背部皮下植入,于2、4周處死動(dòng)物,行大體觀察及組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果:組織學(xué)觀察見化學(xué)法(Hudson法)、凍融+酶消化法處理的神經(jīng)其髓鞘清除較徹底,只有部分區(qū)域可見極少量髓鞘殘留,凍融法處理的神經(jīng)內(nèi)可見髓鞘皺縮、變形但有較多殘留。皮下埋植實(shí)驗(yàn)觀察見單純凍融法處理的神經(jīng)內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)稍多,主要分布在神經(jīng)束周邊的基

13、底膜間隙中,Hudson法、凍融+酶消化法處理的神經(jīng)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論:凍融+酶消化法處理方法簡(jiǎn)單、神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)保存完整,神經(jīng)內(nèi)髓鞘等抗原成分去除較徹底,是一種良好的去細(xì)胞方法,為后期實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二:脫細(xì)胞神經(jīng)復(fù)合GDNF轉(zhuǎn)染的MSCs修復(fù)兔面神經(jīng)缺損
　　目的:以脫細(xì)胞面神經(jīng)為支架,復(fù)合GDNF轉(zhuǎn)染的MSCs修復(fù)兔面神經(jīng)多分支缺損,觀察其對(duì)面神經(jīng)再生及對(duì)面神經(jīng)元存活的作用。
　　方法

14、:新西蘭大白兔60只,面神經(jīng)解剖性損傷造模。完全隨機(jī)分為:脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植組(ANA),脫細(xì)胞異體神經(jīng)+間充質(zhì)干細(xì)胞組(AN-MSCs),脫細(xì)胞異體神經(jīng)+GDNF轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞(AN-G-MSCs),自體神經(jīng)移植組(Control)。于術(shù)后4、12、24周時(shí)取材,對(duì)動(dòng)物行大體觀察并采用觸須運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)電生理等方法對(duì)面神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)估,分別對(duì)移植神經(jīng)的近端及遠(yuǎn)端行甲苯暗藍(lán)染色、透射電鏡觀察其再生軸突的變化。
　　結(jié)果:對(duì)面神

15、經(jīng)總干處神經(jīng)軸突形態(tài)計(jì)量學(xué)分析發(fā)現(xiàn),術(shù)后4周時(shí)脫細(xì)胞神經(jīng)移植組其神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、髓鞘直徑均明顯低于其他三組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后12、24周時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。面神經(jīng)移植物遠(yuǎn)端術(shù)后12周時(shí)面神經(jīng)各分支檢測(cè)脫細(xì)胞神經(jīng)移植與 MSCs組神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)、髓鞘厚度、髓鞘直徑均明顯低于GDNF組與自體神經(jīng)移植組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后24周時(shí)脫細(xì)胞神經(jīng)移植各項(xiàng)指標(biāo)均低于其他三組。

16、r>　　結(jié)論:將脫細(xì)胞神經(jīng)與 GDNF轉(zhuǎn)染的 MSCs聯(lián)合應(yīng)用可成功修復(fù)兔面神經(jīng)多分支缺損,其修復(fù)效果優(yōu)于單純應(yīng)用脫細(xì)胞神經(jīng),且可以一定程度上保護(hù)面神經(jīng)元的存活。
　　實(shí)驗(yàn)三:同種異體神經(jīng)移植修復(fù)面神經(jīng)缺損的長(zhǎng)期隨訪觀察
　　目的:臨床應(yīng)用脫細(xì)胞神經(jīng)移植修復(fù)面神經(jīng)缺損,并進(jìn)行長(zhǎng)期的隨訪,觀察其修復(fù)效果及安全性。
　　方法:2004年7月至2013年7月,因外傷或腮腺惡性腫瘤侵襲術(shù)中切除導(dǎo)致的面神經(jīng)缺損44例,最終共有3

17、5例神經(jīng)缺損修復(fù)患者完成隨訪觀察,其中自體神經(jīng)移植20例,脫細(xì)胞神經(jīng)移植15例。術(shù)后最短隨訪時(shí)間為9個(gè)月,隨訪時(shí)分別進(jìn)行局部超聲檢查和血常規(guī)檢查,并按HB標(biāo)準(zhǔn)觀察面神經(jīng)功能。
　　結(jié)果:隨訪時(shí)間9月-9年,面神經(jīng)缺損長(zhǎng)度10mm-50mm,其中術(shù)中一期缺損修復(fù)26例,二期手術(shù)移植9例,二期手術(shù)距損傷時(shí)間2天-3個(gè)月。術(shù)后隨訪時(shí)的血常規(guī)檢及超聲查均未發(fā)現(xiàn)無(wú)異常,表明脫細(xì)胞神經(jīng)植入體內(nèi)后未引起明顯的不良反應(yīng)。最終自體神經(jīng)移植組與脫細(xì)胞