中華仙影?？幸活惾芗?xì)胞多肽CCT-I的分離、鑒定及體外性質(zhì)研究.pdf

1、中華仙影?？鸆ereus sinensis Verrill屬于綠?？葡捎昂？麑?，是我國沿海普遍分布的一種有毒海葵，也是一味常用海洋藥物，具有收斂固澀、祛濕殺蟲和滋陰壯陽等功效，民間主要用來治療痔瘡、脫肛、饒蟲病和體癬等。中華仙影海葵觸手內(nèi)含有大量的刺絲囊，內(nèi)含豐富的?？舅?，主要為神經(jīng)類和溶細(xì)胞類蛋白質(zhì)或多肽毒素，這些毒素具有多種生物活性，一直以來都是海洋生物毒素研究的重要內(nèi)容。本文以中華仙影?？械娜芗?xì)胞毒素為研究對象，利用凍融、鹽

2、析、柱層析、電泳、HPLC及LC-MS對其進(jìn)行提取、分離、純化和鑒定;并進(jìn)行了這類毒素的體外穩(wěn)定性、抗腫瘤活性以及對小鼠的急性毒性試驗。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、中華仙影?？芗?xì)胞毒素的分離純化及鑒定:采用正交試驗優(yōu)化出海葵溶細(xì)胞毒素的最適合提取方法，并利用硫酸銨鹽析的方法得到初步純化的?？舅?，通過Sephadex G-100、Superdex75、Source15Q色譜分離、純化得到一個含有兩個多肽的純度較高的溶細(xì)胞活

3、性組分。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，這兩個多肽的分子量均在80 kDa左右，分別對這兩個多肽進(jìn)行LC-MS鑒定，結(jié)果顯示這兩個多肽的斷裂片段相似，但在NBCI庫中卻無相似的多肽，故推測其為一類新型的海葵溶細(xì)胞毒素，該活性組分命名為CCT-Ⅰ。
　　2、CCT-Ⅰ的體外溶細(xì)胞活性及影響因素的研究:CCT-Ⅰ具有很強(qiáng)的溶細(xì)胞活性，其濃度大約在5.75μg·mL-1時便可以引起半數(shù)的2％大鼠紅細(xì)胞混懸液的破裂。但過高或過低的孵育溫度、強(qiáng)

4、堿或強(qiáng)酸條件及隨著放置時間的延長，都會導(dǎo)致CCT-Ⅰ溶細(xì)胞活性的降低;此外，不同的金屬離子，如Cu2+，Mg2+，Zn2+和Ca2+都可以抑制CCT-Ⅰ的溶細(xì)胞活性，但EDTA對CCT-Ⅰ的活性具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用具濃度依賴性。
　　3、CCT-Ⅰ的體外抗腫瘤活性的研究:采用MTT法研究了不同濃度的CCT-Ⅰ對人宮頸癌Hela細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示:CCT-Ⅰ對這兩株腫瘤細(xì)胞的生長都具有較強(qiáng)的抑制作用，對H

5、ela腫瘤細(xì)胞和A549腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制數(shù)分別為14.52μg·mL-1和22.18μg·mL-1，而且當(dāng)CCT-Ⅰ的濃度為50μg·mL-1時，其對Hela腫瘤細(xì)胞和A549腫瘤細(xì)胞的抑制率均超過了70％。
　　4、CCT-Ⅰ對小鼠的急性毒性研究:采用小鼠尾靜脈注射法研究了CCT-Ⅰ的急性毒性，得出CCT-Ⅰ對小鼠尾靜脈注射的半數(shù)致死數(shù)為173.57μg/kg，雖然實(shí)驗致死小鼠各內(nèi)臟的表觀形態(tài)與生理鹽水對照組的差異并不明顯，但