海葵溶細(xì)胞素Gigantoxin-4的分離、鑒定和功能研究.pdf

1、?？芗?xì)胞素(actinoporin)是一類分子量在20kDa 左右，對膜上鞘磷脂有特異性作用的一類的蛋白家族。目前，已經(jīng)從30多種?？蟹蛛x鑒定了多種溶細(xì)胞素。有毒?？U傷是一種常見的海洋生物傷，因此，分離、提取和鑒定我國沿海代表性有毒海葵毒素，并深入研究其生物活性，不僅可以獲得具有生物活性的有效成分，還可以為?？貍尼槍π杂行Х雷o(hù)與治療策略提供理論依據(jù)，并可能為新藥研制提供重要的研究思路及治療靶點(diǎn)。本課題選擇我國南海代表性的有毒海

2、葵—巨形列指海葵（Stichodactyla gigantea）為研究對象，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：1. 海葵溶細(xì)胞素Gigantoxin-4的分離與鑒定。首先，提取新鮮觸手組織中的粗毒組分，建立了相對特異的蛋白雙向電泳譜圖。然后采用快速蛋白液相色譜技術(shù)(FPLC)分離其中的具有溶血活性的組分，先用Hitrap Capto S 陽離子交換色譜獲得了兩個(gè)具有溶血活性的組分，接著用Superdex 75 prep grade 凝膠色譜進(jìn)一步

3、純化前面得到的活性組分，結(jié)果獲得兩個(gè)分子量19 kDa 左右的純度較高的溶血活性組分。將其中一個(gè)純度較高的活性組分進(jìn)行質(zhì)譜分析和N 端部分氨基酸序列測定，結(jié)果表明得到的部分序列與已報(bào)道的幾種?？芗?xì)胞素如Cytolysin-3(HMg III)、RTX-A、Sticholysin-1(StI)、Sticholysin-2(St II)有較高的同源性，等電點(diǎn)為9.3，我們將這個(gè)蛋白命名為Gigantoxin-4。2. Gigantoxin

4、-4的溶血活性及影響因素分析。Gigantoxin-4 具有很強(qiáng)的溶血活性，濃度為40ng/mL時(shí)，即可引起50％的紅細(xì)胞溶血，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)該毒素可以導(dǎo)致紅細(xì)胞變形甚至破碎。我們還探討了溫度、pH、室溫放置時(shí)間、凍融次數(shù)、金屬離子等理化因素對其溶血活性的影響，確定Gigantoxin-4溶血活性的最適條件是pH 7.4、37℃條件下反應(yīng)30～40min，高溫、強(qiáng)酸堿、反復(fù)凍融和室溫放置過久都會降低Gigantoxin-4

5、溶血活性。不同的金屬離子對Gigantoxin-4的溶血活性有不同的影響，Mg2+、K+能夠促進(jìn)Gigantoxin-4的溶血活性，且K+的促進(jìn)作用比Mg2+強(qiáng)，Ca2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+和Zn2+等金屬離子能不同程度地抑制Gigantoxin-4的溶血活性。我們還研究了不同磷脂組成的小單層囊膜脂質(zhì)體(SUV)對海葵溶細(xì)胞素Gigantoxin-4溶血活性的影響。結(jié)果表明，Gigantoxin-4能與SM、SM:PC(1:1

6、)、SM:Cho(1:1)及SM:PC:Cho(1:1:1)構(gòu)成的脂質(zhì)體相互作用， 從而競爭性地抑制了Gigantoxin-4的溶血活性。3. Gigantoxin-4的生物學(xué)活性研究。我們以不同磷脂組成的包裹鈣黃綠素的大單層囊膜脂質(zhì)體(LUV)為模型研究Gigantoxin-4對LUV的透性作用，結(jié)果與第二部分SUV對Gigantoxin-4溶血抑制作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，膜上的鞘磷脂的存在對于Gigantoxin-4 發(fā)揮作用有著重

7、要的意義，而膽固醇的存在更有利于Gigantoxin-4和鞘磷脂的結(jié)合。我們還發(fā)現(xiàn)?？芗?xì)胞素Gigantoxin-4 具有類似于鞘磷脂酶的活性，能夠水解特異性的底物TNPAL-SM，但該結(jié)論還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。采用MTT 法檢測Gigantoxin-4的細(xì)胞毒作用，結(jié)果表明其對腫瘤細(xì)胞MCF-7、SW-1990等均有殺傷作用，IC50分別為1.71和1.32 μg/mL。流式細(xì)胞儀對細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果表明，1μg/mL Gigan

8、toxin-4幾乎不誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡，以壞死為主。對小鼠尾靜脈注射Gigantoxin-4的急性毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Gigantoxin-4的半數(shù)致死量約為73.6 μg/kg，且毒性效應(yīng)快速、劇烈。通過股靜脈給予大鼠注射Gigantoxin-4，在60μg/kg 劑量下，15 min內(nèi)會導(dǎo)致大鼠呼吸衰竭而死亡，組織病理切片結(jié)果證實(shí)肺部是損傷最嚴(yán)重的臟器；在30μg/kg 劑量下，大鼠可以存活幾個(gè)小時(shí)，最終還是會死于心臟和呼吸衰竭。血清

9、生化檢測結(jié)果表明靜脈注射Gigantoxin-4 (30μg/kg)后，肝臟和心臟損傷相關(guān)的酶如ALT、AST、LDH、CK、CK-MB等都有顯著的升高。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論：我們從?？鸖tichodactyla gigantea的觸手組織中分離純化出一種19 kDa 左右的溶細(xì)胞素Gigantoxin-4，等電點(diǎn)約為9.3，通過N 端序列測定及LC-MS 鑒定了其N 端氨基酸序列及部分其他序列，比對結(jié)果顯示，與HMgIII、RT

10、X-A、St I、St II等有較高的同源性；本實(shí)驗(yàn)還從分子水平、細(xì)胞水平以及整體動物水平對Gigantoxin-4的生物學(xué)活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該毒素具有很強(qiáng)的溶血活性和細(xì)胞毒作用，并有一定類似鞘磷脂酶的活性，靜脈注射大鼠能導(dǎo)致以肺和心臟為主的各個(gè)臟器的損傷、衰竭；此外，通過顯微觀察、脂質(zhì)體模型、流式細(xì)胞術(shù)等方法對其活性進(jìn)行了初步的機(jī)理探討，證實(shí)該毒素能與膜上的鞘磷脂結(jié)合，形成孔洞或使其降解，從而導(dǎo)致膜的變形破碎。隨著對海洋資源的日益關(guān)