加味三棱丸對子宮內膜異位癥雌激素生成的影響及機制研究.pdf

1、內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，雌激素的合成代謝在內異癥疾病的發(fā)生、發(fā)展中占有重要的地位。既往研究提示，加味三棱丸有效成分(以下簡稱SLW)具有良好的抗子宮內膜異位癥作用。因此，以“EMS是雌激素依賴性疾病”為切入點，探討SLW源頭治療內異癥的作用靶點及機制，可為其早日成為新的內異癥治療藥物提供基礎研究依據(jù)。 目的:觀察SLW對內異癥在位內膜雌二醇生成水平的影響，及其對參與雌二醇生成過程中惡性正反饋循環(huán)的關鍵酶及轉錄因子的影響

2、；觀察SLW對大鼠異位子宮內膜的發(fā)展、雌二醇生成、粘附及抗凋亡能力的影響，并進一步探討SLW抑制內異癥內膜細胞中雌二醇的生成在其抗子宮內膜異位癥中的關鍵作用機制。方法 1.培養(yǎng)內異癥和非內異位癥在位內膜(Eu and En)細胞，分為非內異癥內膜細胞組、內異癥內膜細胞組、SLW 170μg/ml組、17μg/ml組、1.7μg/ml組及0.1mg/kg阿那曲唑組。采用WST-8法檢測SLW對Eu和En細胞增殖情況的影響，RT-P

3、CR法和western blot檢測En細胞及SLW處理后的Eu細胞中細胞色素P450芳香化酶(P450 arom)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)，類固醇類生成因子-1(SF-1)、小雞卵清蛋白上游啟動子轉錄因子(COUP-TF)mRNA及其蛋白的表達，17-β-羥甾類脫氫酶1，2(17-β-HSD 1，2)mRNA的表達情況；細胞免疫熒光法觀察En細胞及SLW處理后的Eu細胞中SF-1和COUP-TF蛋白的表達，電化學發(fā)光免疫法和放射免

4、疫法分別檢測SLW對Eu細胞培養(yǎng)液上清中雌二醇(E2)和前列腺素E2(PGE2)水平的影響。 2.選擇動情期大鼠行子宮內膜自體移植術，建立大鼠子宮內膜異位癥疾病模型，取移植物積液高度≥2mm，病理學檢查有子宮內膜組織生長的成功模型動物，分為SLW 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組、0.1mg/kg阿那曲唑組、模型對照組，同時設立正常對照組。用藥前經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，除正常對照組外，各組異位內膜體積間無顯

5、著性差異。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)28天。檢測異位內膜體積，常規(guī)HE染色，免疫組織化學法和western blot檢測異位組織中P450 arom和COX-2蛋白的表達；電化學發(fā)光免疫法和放射免疫法分別觀察SLW對異位內膜組織中E2和PGE2水平的影響；免疫組織化學法和TUNEL法分別檢測SLW對大鼠異位子宮內膜中細胞間粘附分子(ICAM-1)蛋白表達及細胞凋亡的影響。 3.首先將內膜細胞分為非內異癥內膜細胞對照組、內異癥內膜細胞對照組

6、和SLW 17μg/ml組，采用結晶紫染色法檢測內膜細胞的粘附能力，明膠酶譜法分析內膜細胞分泌基質金屬蛋白酶2,9(MMP-2,9)及其酶原的活性，細胞免疫熒光法觀察組織型金屬蛋白酶抑制劑1，2(TIMP-1，2)蛋白的表達，ELISA法檢測內膜細胞培養(yǎng)上清中血管內皮生長因子(VEGF)的含量，流式細胞術和TUNEL法分別檢測內膜細胞早期和晚期凋亡率。同時選取SLW的各測定指標最佳作用時間點，作為后續(xù)實驗的檢測時間點。隨后，將SLW 1

7、7μg/ml與終濃度為1.34pg/ml～6.36pg/ml的雌二醇進行聯(lián)合干預，并同時設計0.1μg/ml阿那曲唑組和終濃度為1.34pg/ml～6.36pg/ml的雌二醇組作為正反對照，在各檢測時間點上按照上述方法對各項指標進行檢測。 結果 1.WST-8法結果提示，體外培養(yǎng)的Eu細胞在各時相點的增殖速度，明顯高于En細胞(P＜0.05)，但SLW對Eu細胞的增殖能力沒有顯著的影響；SLW 170μg/ml和17μg

8、/ml組在作用48h、72h和96h時，分泌雌二醇的水平較Eu細胞對照組明顯降低，差異顯著(P＜0.05)。而SLW1.7μg/ml組僅在96h時顯著降低內異癥在位內膜細胞分泌雌二醇水平，其余各時間點與Eu細胞對照組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。westernblot和RT-PCR結果顯示，給予SLW 170μg/ml、17μg/ml和1.7μg/ml 48h后的Eu細胞，P450 arom、COX-2、SF-1蛋白和mRNA表達

9、較Eu細胞對照組明顯降低，而COUP-TF蛋白和mRNA表達顯著升高(P＜0.05)；細胞免疫熒光結果也顯示，SLW 170μg/ml、17μg/ml組SF-1陽性細胞累積光密度值與Eu細胞對照組比較顯著降低，而COUP-TF陽性細胞累積光密度值顯著升高(P＜0.05)，與western blot和RT-PCR。半定量分析結果一致。同時，放射免疫法結果顯示，SLW 170μg/ml、17μg/ml和1.7μg/ml組細胞上清中PGE2的

10、濃度，明顯低于Eu細胞對照組(P＜0.05)。RT-PCR結果同時顯示，經(jīng)SLW處理后， Eu細胞中HSD-1 mRNA表達顯著減少，而HSD-2 mRNA表達明顯升高，與Eu細胞對照組比較差異顯著(P＜0.05)。 2.造模28天后，腹壁移植物體積增大，出現(xiàn)液體積聚，呈隆起透明的小囊狀，被結締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成。以抑制物積液高度＞2mm，病理學檢查有子宮內膜組織生長為模型成功標準，42只大鼠中40只符合上述標準，造模

11、成功率為95.24％。SLW 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組的移植物體積與模型對照組相比明顯減小，差異顯著(P＜0.05)。艇染色光鏡下觀察模型對照組異位內膜腺上皮細胞呈高柱狀或矮柱狀，排列在囊泡內腔面，細胞間連接較緊密，細胞核大，呈橢圓形，位于基底部，胞漿豐富，內膜間質豐富，其中有個別部位上皮層內陷形成假腺體；SLW 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組和0.1mg/kg阿

12、那曲唑組的內膜腺上皮層明顯變薄，細胞呈矮柱狀甚至扁平狀，松散排列。免疫組織化學和western blot結果顯示，SLw 1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組異位內膜組織中P450 arom蛋白的表達值與模型對照組比較，顯著降低(P＜0.05)；SLW 1.02mg/kg組可以顯著降低模型大鼠異位內膜組織中COX-2蛋白的表達(P＜0.05)，SLW 0.34mg/kg組和0.11mg/kg組雖有一定的降低趨

13、勢，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。同時，電化學發(fā)光免疫法和放射免疫法結果也顯示，SLW1.02mg/kg組、0.34mg/kg組和0.11mg/kg組異位內膜組織中E2和PGE2的濃度，也明顯低于模型對照組(P＜0.05)。 3.將SLW 17μg/ml與Eu細胞共同孵育24h后，ELISA法檢測結果顯示，Eu細胞培養(yǎng)液上清中VEGF的含量顯著高于En細胞組(P＜0.05)；結晶紫染色法、明膠酶譜法和細胞免疫熒光結果分別顯示

14、，48h后Eu細胞的粘附百分數(shù)，MMP-2,9及其酶原的活性顯著高于En細胞，而TIMP-1，2蛋白的表達明顯低于En細胞組(P＜0.05)；流式細胞術和TUNEL法結果分別顯示，72h后的Eu細胞早期凋亡百分數(shù)顯著低于En細胞組，96h后Eu細胞晚期凋亡指數(shù)也顯著低于En細胞組(P＜0.05)；同時，SLW 17μg/ml可同時降低Eu細胞分泌的VEGF含量、細胞粘附百分數(shù)、MMP-2,9及其酶原的活性，上調TIMP-1，2蛋白的表達

15、，增加Eu細胞早期和晚期凋亡數(shù)目，與Eu細胞對照組比較，差異顯著(P＜0.05)。當SLW 17μg/ml與雌二醇1.34pg/ml～6.36pg/ml聯(lián)合給予時，Eu細胞被SLW改善的惡性生物學行為被反向添加的雌二醇部分或完全恢復。其中，Eu細胞的粘附百分率、MMP-2和pro-MMP-9活力、TIMP-1，2蛋白的表達以及Eu細胞培養(yǎng)液上清中VEGF的含量與與Eu細胞對照組比較，已無顯著性差異(P＞0.05)。單加雌二醇可進一步加強

16、Eu細胞的粘附、侵襲、促血管生成及抗凋亡能力，而特異性的芳香化酶抑制劑阿那曲唑0.01μg/ml的作用恰與雌二醇相反。結論1.SLW體外可抑制內異癥在位內膜細胞雌二醇的生成，這種抑制作用非依賴于抑制Eu細胞的增殖，而與抑制Eu細胞SF-1表達，促進COUP-TF表達，特異性地抑制Eu細胞中P450 arom的表達，進而降低P450 arom對COX-2的激活作用，并降低Eu細胞分泌PGE2的水平，從而阻斷內異癥內膜局部雌激素合成的正反饋

17、機制密切有關。此外，SLw體外抑制Eu細胞HSD-1 mRNA表達、促進HSD-2 mRNA表達的作用可能也是其降低Eu細胞雌二醇生成機制之一。 4.Eu細胞在體外與En細胞比較，粘附腹膜、侵襲腹膜基底膜、促血管生成及抗自身凋亡的能力更強，Eu細胞的上述特質受其局部雌二醇濃度的影響。SLW可抑制Eu細胞粘附、侵襲、促血管生成，促進Eu細胞凋亡，其機制與SLW抑制Eu細胞與Ⅰ型膠原的特異性粘附，降低MMP-2,9活力，提高TIM