加味三棱丸主要成分抗大鼠子宮內(nèi)膜異位癥血管生成與侵襲及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的： 觀察加味三棱丸主要成分(簡稱SLW)對大鼠異位子宮內(nèi)膜的發(fā)展、血管生成、血管侵襲和慢性炎癥肉芽組織血管新生的影響；觀察SLW對人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干預(yù)作用。研究SLW抗子宮內(nèi)膜異位癥的效果，并探討其作用機(jī)制。 方法： 1．選擇動(dòng)情期大鼠行子宮內(nèi)膜自體移植術(shù)，建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥疾病模型。采用正交設(shè)計(jì)，根據(jù)L9(33)正交表分組、給藥。4個(gè)

2、星期以后，以移植物體積大小和血清中雌二醇(E2)、孕激素(P)值為考察指標(biāo)，對加味三棱丸3種主要成分A、B、C每種成分的三個(gè)不同濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定SLW中藥物的最佳配比。以最佳配比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 2．5E式試驗(yàn)參照前述方法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥疾病模型，根據(jù)移植物體積大小重新分組。根據(jù)最佳配比，確定SLW高、中、低3個(gè)劑量組，灌胃給藥，每天1次連續(xù)28天。等容積灌胃0．5mg．kg-1孕三烯酮作為陽性對照。檢測異位內(nèi)膜體積，血清

3、E2、P水平；ELISA法檢測腹腔液中血管內(nèi)皮生長因子VEGF含量；常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)法觀察異位組織基質(zhì)金屬蛋白酶一9(MMP-9)、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制一1(TIMP．1)的表達(dá)和微血管密度(MVD)；RT-PCR方法檢測MMP-9mRNA、TIMP．1mRNA的表達(dá)。 3．大鼠皮下移植人工海綿，分別灌胃給予不同濃度SLW，14天后行安樂死，取出海綿及包繞的周圍組織。常規(guī)HE染色，免疫組化進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞特異性Ⅷ因子染色

4、，計(jì)算微血管密度(MVD)；應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量每個(gè)病理切片中海綿內(nèi)新生肉芽組織生長面積，以及該面積占整個(gè)海綿切片面積的百分比；RT-PCR法、Westemblot分別檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA及其蛋白的表達(dá)。 4．培養(yǎng)人巨噬細(xì)胞U937，給予不同濃度脂多糖(5μg-m1-1、10μg·m1-1、50gg．mi-1、1001~g．ml'1)刺激U937分泌VEGF，ELISA方法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEG

5、F的含量，根據(jù)VEGF含量多少選擇脂多糖最佳刺激濃度納入后續(xù)試驗(yàn)。收集巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)液，分別加入不同濃度SLW，魚精蛋白(陽性對照)，作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。Transwell小室檢測SLW對HUVEC侵襲能力的影響；MTT法檢測藥物對HUVEC增殖的影響；免疫組化觀察SLW對HUVEC表達(dá)VEGF和Flk-1的影響；細(xì)胞免疫熒光觀察SLW對HUVEC中磷酸化ERK表達(dá)的影響；Westemblot檢測SLW對H

6、UVEC中VEGF、Flk-1蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1、正交試驗(yàn)結(jié)果 造模4周后，腹壁移植物體積增大，出現(xiàn)液體積聚，呈隆起透明的小囊狀，被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成。切取移植物送檢，證實(shí)移植物中有子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體及間質(zhì)的生長。以移植物體積>8mm3，并顯示積液，病理學(xué)檢查有子宮內(nèi)膜組織生長為模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。40只大鼠中30只符合上述標(biāo)準(zhǔn)，造模成功率75％。 經(jīng)正交試驗(yàn)多因素方差分析，綜

7、合異位內(nèi)膜體積，血清E2、P水平等3項(xiàng)藥效學(xué)指標(biāo)，篩選出SLW3種主要成分最佳配比為A283C1。 SLW最佳配比治療組大鼠異位組織體積減小158．7+41．7mm3，模型對照組體積增大30．7+43．8Iiliil3，兩者相比差異顯著(P<0．05)；最佳配比治療組E2值18．35+9．42pg．ml'l，較模型對照組E2值65．45士4．15pg．ml'l顯著性降低(P<0．05)；最佳配比組P值為15．704-1．00ng

8、．m1-1，與模型對照組P值10．514-1．90ng．m1-1相比沒有顯著性差異(P＞O．05)。 2、SLW抗大鼠子宮內(nèi)膜異位癥藥效學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 按照上述造模方法和模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)，52只大鼠造模4周后40只符合上述標(biāo)準(zhǔn)，造模成功率為76．92％。SLW高、中劑量組移植物體積分別為7．64-3．6mm3和20．54-11．9mm3，與模型對照組63．44-37．2mm3相比，體積減小，有顯著性差異(P<0．05)。HE

9、染色光鏡觀察模型對照組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈高柱狀或矮柱狀，排列在囊泡內(nèi)腔面，細(xì)胞間連接較緊密，細(xì)胞核大，呈橢圓形，位于基底部，胞漿豐富，內(nèi)膜問質(zhì)豐富，其中有個(gè)別部位上皮層內(nèi)陷形成假腺體；SLW高、中劑量組和孕三烯酮組，內(nèi)膜腺上皮層明顯變薄，細(xì)胞呈矮柱狀甚至扁平狀，松散排列。SLW高、中、低劑量組E2值分別為17．674-1．54，31．40-~：6．66，32．854-¨．04，與模型對照組E2值78．934-9．53pg．ml'l比較

10、，顯著降低(P＜O．01，P

11、，陽性程度和面積評分與模型對照組比較差異顯著(P<0．05)。經(jīng)SLW治療后，EMS大鼠異位內(nèi)膜組織MMP-9mRNA的表達(dá)顯著減少，其條帶相對光密度分別為3．28±O．16、2．954-0．24、2．034-1．41，與模型對照組條帶相對光密度5．554-0．64比較有顯著性差異(P<0．05)。SLW高、中、低劑量組TIMP．1mRNA表達(dá)量有不同程度升高，其條帶相對光密度分別為1．23~0．04，1．144．0．04，1．364．

12、0．42,與模型對照組0．654．0．14比較，差異顯著(P<0．05)。 4．SLW抗血管生成試驗(yàn)結(jié)果 VIII因子染色結(jié)果顯示：模型對照組異位組織血管豐富，血管數(shù)目多且密集，微血管密度MVD為30．304-2．44，SLW高、中劑量組血管數(shù)量較少，MVD分別為20．66~1．78，23．00~2．00，與模型對照組相比有顯著性差異(P<0．05)。SLW高、中劑量組可顯著降低大鼠腹腔液中VEGF含量，VEGF含量分別

13、為578．57~96．10pg．ml'l，1014．29~103．02pg．ml'l與模型對照組VEGF含量1545．24~272．02pg．ml'l比較差異顯著(P

14、較生理鹽水對照組2．29~0．86pg．ml'1明顯增加，差異顯著(P

15、5)。細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示：SLW高、中劑量組VEGF平均光密度值為187．384-13．63和218．844．13．63，與空白對照組247．074．12．82比較明顯降低，差異顯著(P

16、中劑量組可抑制VEGF在HUVEC細(xì)胞中的表達(dá)，其相對光密度值分別為0．914-0．13、1．084．0．06，與空白對照組1．574．0．20比較明顯降低，差異顯著(P

17、度聚集，EKR表達(dá)水平高，而SLW高、中劑量組，胞漿與胞核淺染，EKR表達(dá)水平降低。 結(jié)論： 1．SLW可抑制大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展，縮小異位內(nèi)膜體積，改善異位內(nèi)膜組織病理學(xué)變化，降低血清雌二醇含量。 2．SLW可抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜血管侵襲，其機(jī)制與SLW抑制異位內(nèi)膜組織MMP-9表達(dá)，增強(qiáng)TIMP．1表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲能力相關(guān)。 3．SLW可抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜血管生成，