小鼠髓樣抑制細胞體外擴增及Notch信號分子表達分析.pdf

1、目的:
　　髓樣抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是一群來源于髓樣祖細胞的異質性細胞，具有未成熟細胞的表型和免疫抑制功能。多年來研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路與多種血細胞的發(fā)育、分化增殖和凋亡密切相關。本研究的目的是探討體外誘導小鼠MDSC擴增的方法及影響因素，并進一步分析體外擴增的MDSC Notch信號分子的表達情況，以期為探究MDSC的體外擴增機制及研究MDSC相關疾病的發(fā)病機

2、理提供新的思路。
　　方法:
　　(1)探尋MDSC體外擴增的最佳細胞因子濃度。實驗分為五組，分別采用10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6、20ng/ml GM-CSF和20ng/mlIL-6、40ng/ml GM-CSF和40ng/ml IL-6、10ng/ml GM-CSF、10ng/mlIL-6刺激2.5×105個/ml的新鮮骨髓細胞培養(yǎng)4d，流式細胞術檢測MDSC和MDSC亞群(粒細胞樣MDSC:

3、PMN-MDSC和單核細胞樣MDSC: MO-MDSC)的比例，并計數(shù)MDSC的絕對數(shù)。根據(jù)實驗結果選取出MDSC體外擴增的最佳細胞因子濃度。
　　(2)探尋MDSC體外擴增的最佳培養(yǎng)時間。實驗分為兩組，使用10ng/mlGM-CSF和10ng/ml IL-6刺激2.5×105個/ml的新鮮骨髓細胞分別培養(yǎng)2d和4d，流式細胞術檢測MDSC、PMN-MDSC和MO-MDSC的比例，并計數(shù)MDSC的絕對數(shù)。根據(jù)實驗結果選取出MDSC

4、體外擴增的最佳培養(yǎng)時間。
　　(3)探尋MDSC體外擴增的最佳新鮮骨髓細胞濃度。實驗分為三組，使用10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6分別刺激1×105個/ml、2.5×105個/ml、5×105個/ml新鮮骨髓細胞培養(yǎng)4d，流式細胞術檢測MDSC、PMN-MDSC和MO-MDSC的比例，并計數(shù)MDSC的絕對數(shù)。根據(jù)實驗結果選取出MDSC體外擴增的最佳新鮮骨髓細胞濃度。
　　(4)采用實時熒光定量PCR和W

5、estern blot檢測體外擴增的MDSC Notch信號分子的表達。
　　結果:
　　(1)小鼠MDSC體外擴增的影響因素有:細胞因子刺激濃度、培養(yǎng)時間、新鮮骨髓細胞濃度。
　?、偌毎蜃勇?lián)合刺激組MDSC的比例均顯著高于新鮮骨髓細胞未刺激組和單獨GM-CSF或IL-6刺激組（P均＜0.05），但三組之間未見明顯差異。五組不同濃度細胞因子刺激組PMN-MDSC的比例均顯著低于新鮮骨髓細胞未刺激組（P均＜0.05），

6、而MO-MDSC的比例則顯著高于新鮮骨髓細胞未刺激組（P均＜0.05）。提示10ng/ml GM-CSF和10ng/ml IL-6是最佳細胞因子濃度組合。
　?、谄渌囵B(yǎng)條件固定時，培養(yǎng)4d的MDSC比例和絕對數(shù)均明顯高于培養(yǎng)2d的比例（P均＜0.05）。但兩組間PMN-MDSC和MO-MDSC的比例未見明顯差異（P均＞0.05）。提示4d是最佳培養(yǎng)時間。
　?、燮渌囵B(yǎng)條件固定時，骨髓細胞濃度為2.5×105個/ml組誘導

7、的MDSC比例和絕對數(shù)均顯著高于其他兩個細胞濃度組（1×105個/ml、2.5×105個/ml）（P均＜0.05）。但三組間PMN-MDSC和MO-MDSC的比例未見明顯差異（P均＞0.05）。提示2.5×105個/ml是最佳新鮮骨髓細胞濃度。
　　(2)MDSC體外擴增體系中Notch信號相關分子的表達情況。
　　與新鮮骨髓細胞相比，MDSC體外擴增體系中Notch信號相關受體 Notch3的mRNA和蛋白表達水平均顯著降

8、低（P均＜0.05），而Notch1、Notch2和Notch4表達水平無明顯差異P均＞0.05）;Notch信號相關配體Jaggedl mRNA的表達水平明顯增高(P＜0.05)，Dll1和Dll4的表達水平則顯著下降（P均＜0.05），而Jagged2的表達水平未見明顯差異(P＞0.05);Notch信號通路中下游活化靶基因Hes1 mRNA的表達水平也顯著低于新鮮骨髓細胞(P＜0.05)，而Hes5和Hey1的表達水平無明顯差異（