天然抗角蛋白自身抗體轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及相關(guān)研究.pdf

1、該課題組以往的研究進展已經(jīng)為轉(zhuǎn)基因小鼠的建立奠定了良好的基礎(chǔ):我們應(yīng)用未免疫小鼠B細胞與骨髓瘤細胞融合,成功篩選到了4株分泌抗角蛋白IgM抗體的雜交瘤,并發(fā)現(xiàn)單克隆抗角蛋白抗體的親和力差異很大.這些更具天然性的未免疫小鼠雜交瘤抗體的獲得不僅有助于我們進一步探討AK auto Ab的特性和生物學(xué)作用,更為深入研究AK auto Ab的產(chǎn)生機制等長久以來困擾我們的難題提供了非常好的實驗材料.該研究首先從小鼠表皮提取了小鼠角蛋白,然后應(yīng)用NH

2、<,4>SCN洗脫法比較了天然抗角蛋白雜交瘤抗體的相對親和力,選擇高親和力的抗角蛋白抗體用以構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠,并初步進行了表型分析.一、轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及表達;采用RT-PCR方法克隆分泌AK auto Ab的雜交瘤3B4的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,連接抗體轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子及恒定區(qū)基因序列,構(gòu)建成重鏈轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pICμ-V<,2H7>和輕鏈轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒pBSCk-2Vk4.電穿孔法進行了體外真核細胞轉(zhuǎn)染,ELISA、RT-PCR、流式細胞儀方法

3、驗證轉(zhuǎn)基因載體可以表達抗體3B4基因.二、抗體重鏈轉(zhuǎn)基因小鼠建立及基因型分析;將線性化的質(zhì)粒顯微注射入CBA×C57BL/6小鼠的受精卵細胞的雄前核內(nèi),然后導(dǎo)入假孕雌鼠的輸卵管.共注射約200枚卵,娩出小鼠80只.提取小鼠尾巴基因組DNA進行PCR分析,共獲得12只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠.Southern blot分析進一步證實轉(zhuǎn)基因存在.三、抗體重鏈轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析;四、AK auto Ab產(chǎn)生的細胞基礎(chǔ)研究;該研究成功建立了AK auto