雷帕霉素和他克莫司對(duì)大鼠肝移植后急性移植物抗宿主病的不同作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝移植后急性移植物抗宿主病是一種發(fā)病率較低(1％-2％)但死亡率高達(dá)85％-90％的疾病，無(wú)論是診斷方面還是治療方面都面臨著巨大的挑戰(zhàn)。大多數(shù)肝移植病人發(fā)病后出現(xiàn)全身性敗血癥、骨髓抑制和多器官功能衰竭。現(xiàn)有的治療方法尚且存在很多爭(zhēng)議，主要包括：增加免疫抑制劑、減少或間斷性應(yīng)用免疫抑制劑、抗淋巴細(xì)胞治療(如抗胸腺細(xì)胞球蛋白、抗淋巴細(xì)胞球蛋白或單克隆抗淋巴細(xì)胞因子OKT3)、抗IL-2受體抗體(如daclizumab、basiliximab

2、)和輸入宿主免疫細(xì)胞。
　　 肝移植后急性移植物抗宿主病的發(fā)病機(jī)制并不明確。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，目前對(duì)本病研究仍主要停留在臨床病例報(bào)告和總結(jié)上，建立一個(gè)穩(wěn)定的、可重復(fù)的動(dòng)物模型能更深入的研究該疾病發(fā)生過(guò)程中免疫系統(tǒng)的改變?nèi)绾螌?dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展，并探索一種新的更為有效的治療方法。經(jīng)過(guò)幾年的研究，我們成功的建立了世界上首個(gè)供體主導(dǎo)的供受體MHC單體單向相合的急性移植物抗宿主病的大鼠模型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目和比例的降

3、低相關(guān)。
　　 本研究旨在于觀察FK506和RAPA對(duì)大鼠LTx-aGVHD的不同作用，并研究疾病的發(fā)生發(fā)展和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例變化的相關(guān)性。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 以雄性Lewis大鼠作為供體，(Lewis X BN)F1大鼠作為受體，肝臟移植術(shù)后30min內(nèi)自陰莖背靜脈輸入新鮮制備的4×108供體源脾臟細(xì)胞。依據(jù)大鼠發(fā)病后不同的治療方案分為以下三組：(1)對(duì)照組：受體不應(yīng)用

4、任何藥物治療。(2)FK506組：受體在肝移植術(shù)后第8天開(kāi)始灌胃，1mg/kg/天，連續(xù)8天，血藥濃度達(dá)到10-12ng/ml。FKS06用PBS稀釋。(3)RAPA組：受體在肝移植術(shù)后第8天開(kāi)始灌胃，1mg/kg/天，連續(xù)8天，血藥濃度達(dá)到2-3ng/ml。
　　 二、aGVHD的檢測(cè)
　　 術(shù)后每日觀察aGVHD相關(guān)大體表現(xiàn)如皮炎、脫毛、腹瀉、弓背等現(xiàn)象。在動(dòng)物死亡時(shí)或術(shù)后16天留取皮膚、大腸、小腸組織標(biāo)本，常規(guī)固定

5、、染色后光鏡下觀察aGVHD相關(guān)病理表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)分析各組受體aGVHD的生存時(shí)間。
　　 三、外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)
　　 外周血血細(xì)胞梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例。
　　 四、免疫組化(sABC法)法檢測(cè)腸道組織中Foxp3的表達(dá)
　　 測(cè)定皮膚標(biāo)本中Foxp3的表達(dá)，分析Foxp3+細(xì)胞在皮膚組織單個(gè)核細(xì)胞中所占的比例與大

6、鼠LTx-aGVHD受體生存率之間的相關(guān)性。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS15.0軟件完成，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以X±s表示。生存分析和組間比較以ANOVA檢驗(yàn)通過(guò)最小顯著性測(cè)試(LSD)進(jìn)行，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、aGVHD的大體表現(xiàn)和病理表現(xiàn)
　　 在大鼠模型中所有的同種異基因移植受體均發(fā)生aGVHD。最早的大體變化發(fā)生在移植術(shù)后7-10天

7、，大鼠出現(xiàn)輕度皮疹、耳廓靜脈充血和腹瀉。對(duì)照組大鼠aGVHD癥狀繼續(xù)惡化直至死亡。FK506組和RAPA組最終死亡的大鼠發(fā)病情況與對(duì)照組大鼠相似；但對(duì)于長(zhǎng)期存活的大鼠，aGVHD癥狀逐漸消失，皮炎、脫毛、腹瀉、惡病質(zhì)等臨床表現(xiàn)好轉(zhuǎn)，體重逐漸穩(wěn)定。
　　 對(duì)照組大鼠皮膚的病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)aGVH表現(xiàn)，表皮角化不良甚至松解、表皮和真皮層中出現(xiàn)中性粒及單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，基底膜的退變。FK506組大鼠皮膚有部分中性粒及單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，RAP

8、A組大鼠皮膚病理學(xué)檢測(cè)無(wú)明顯中性粒及單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 二、移植后受體死亡率和生存時(shí)間
　　 在對(duì)照組中，所有的受體均死于肝移植后19-29天.在FK506組中受體死亡率為50％(4/8)，顯著低于對(duì)照組中的死亡率。在RAPA組，只有一例同種異體受體死亡，死亡率顯著低于對(duì)照組和FK506組。
　　 三、Foxp3免疫組化表達(dá)
　　 在腸道組織中對(duì)照組、FK506組、RAPA組的Foxp3的表達(dá)分別是0

9、.9±0.4％，1.0±0.5％和3.8±1.5％.Foxp3的表達(dá)在RAPA組顯著高于對(duì)照組或FK506組。
　　 四、移植術(shù)后外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例變化
　　 對(duì)照組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例在肝移植術(shù)后第12天和第16天逐漸降低到3.1±0.4％和2.0±0.4％；在FK506組大鼠流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，但是RAPA組大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組和FK506組的受