細(xì)胞因子動(dòng)員的骨髓移植對(duì)急性移植物抗宿主病的影響.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定可靠的急性GVHD小鼠模型，對(duì)細(xì)胞因子G-CSF單用及聯(lián)合甲強(qiáng)龍、環(huán)孢素A動(dòng)員后所獲得的移植物細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子的變化進(jìn)行測定，對(duì)供體采取這些措施進(jìn)行異基因骨髓移植后急性GVHD和移植物抗白血病效應(yīng)（GVL）的變化與對(duì)照組進(jìn)行比較分析，研究不同來源移植物影響急性GVHD的可能機(jī)制，探討在實(shí)施HLA半相合移植中對(duì)供體采用細(xì)胞因子聯(lián)合甲強(qiáng)龍、環(huán)孢素動(dòng)員的可能性，為預(yù)防治療急性GVHD提供新思路.方法：1）選擇C57B

2、L/6小鼠作供體，B6D2F1、BALB/C小鼠分別作為受體建立小鼠骨髓移植急性GVHD模型，每只小鼠接受5×10<'6>個(gè)骨髓細(xì)胞與2×10<'7>個(gè)脾細(xì)胞混合后尾靜脈注射.應(yīng)用綠熒光轉(zhuǎn)基因小鼠作供體建立標(biāo)記移植物GVHD模型;探討建立小鼠外周血干細(xì)胞移植的急性GVHD模型.以移植后35天生存率、體重變化、癥狀體征綜合評(píng)分系統(tǒng)及肝臟、小腸和皮膚的組織病理變化半定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)GVHD進(jìn)行評(píng)價(jià).2）采用細(xì)胞因子G-CSF單用、G-CSF+

3、甲強(qiáng)龍、G-CSF+甲強(qiáng)龍+環(huán)孢素A三種不同方案動(dòng)員供體小鼠，測定外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓細(xì)胞得率、脾細(xì)胞得率、粒-巨噬細(xì)胞集落（CFU-GM）形成率、CD4+/CD8+比率、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)異基因反應(yīng)性、供體脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1的水平，半定量RT-PCR的測定供體小鼠脾臟細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1 mRNA水平.3）分別采用經(jīng)過上述處理后的移植物進(jìn)行異基因骨髓移植后觀察對(duì)急性GVHD

4、的影響，從動(dòng)物生存率、體重變化曲線、臨床表現(xiàn)、病理組織形態(tài)學(xué)改變等方面進(jìn)行了觀察.選擇移植后第14、21、27、35天不同時(shí)間點(diǎn)流式細(xì)胞儀檢測CD4+/CD8+比率，ELISA測定受體小鼠脾細(xì)胞體外培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1的水平，半定量RT-PCR的測定受體小鼠脾臟細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β1 mRNA水平.4）應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄載體pLNG轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細(xì)胞白血病系A(chǔ)20細(xì)胞，建立了攜帶綠熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因

5、細(xì)胞系A(chǔ)20eGFP，體外細(xì)胞傳代培養(yǎng)比較它與A20細(xì)胞增殖性是否存在差異;分別尾靜脈注射5×10<'6>/只兩種細(xì)胞給BALB/c小鼠進(jìn)行體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)觀察其致瘤性改變.對(duì)荷瘤動(dòng)物進(jìn)行骨髓移植，供體采用經(jīng)過細(xì)胞因子G-CSF及聯(lián)合甲強(qiáng)龍、環(huán)孢素動(dòng)員的小鼠，觀察移植后生存時(shí)間，與對(duì)照組比較肝臟、脾臟、外周血白血病細(xì)胞比例的變化，以此來評(píng)價(jià)移植物抗白血病效應(yīng)的變化.結(jié)論：1）BLAB/C小鼠作為受體建立的致死性急性GVHD模型有可靠的臨床和

6、病理評(píng)價(jià)指標(biāo)，這個(gè)模型在我們對(duì)G-CSF單用及聯(lián)合甲強(qiáng)龍、環(huán)孢素動(dòng)員的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)穩(wěn)定可靠.綠熒光轉(zhuǎn)基因小鼠GVHD模型的病理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)可靠并且便于檢測.H-2不合小鼠間外周血移植GVHD模型移植發(fā)生移植排斥率高，急性GVHD表現(xiàn)不明顯.2）細(xì)胞因子G-CSF動(dòng)員后獲得的細(xì)胞數(shù)量增加、造血干/祖細(xì)胞增加，CD4/CD8比率下降、混合淋巴細(xì)胞異基因反應(yīng)性降低;聯(lián)合應(yīng)用甲強(qiáng)龍、環(huán)孢素動(dòng)員不改變?cè)煅?祖細(xì)胞數(shù)量、CD4/CD8比率、CFU-G

7、M集落形成能力，但使混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)性降低.細(xì)胞因子IL-4、TGF-β1分泌水平增高，IFN-γ的分泌水平降低.3）G-CSF單用及聯(lián)合免疫抑制劑動(dòng)員后異基因骨髓移植可以促進(jìn)供體型完全植入，可以減輕小鼠急性GVHD的臨床表現(xiàn)和組織病理學(xué)改變，其中以G-CSF聯(lián)合甲強(qiáng)龍動(dòng)員效果最好，G-CSF單用及G-CSF+MP+CsA組效果無差異，機(jī)制可能與CD4/CD8比率降低、脾細(xì)胞表達(dá)IFN-γ減低、IL-4、TGF-β1增高相關(guān).4）荷瘤動(dòng)