內皮祖細胞修復慢性脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的：1.設計三種脊髓壓迫裝置，通過比較確定最佳裝置，為進一步研究慢性脊髓壓迫損傷的病理以及恢復奠定基礎。2.從大鼠骨髓中分離出單個核細胞，使用誘導的培養(yǎng)基使其向內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)分化后，將其注入減壓模型以研究內皮祖細胞在慢性脊髓壓迫模型減壓后對其恢復效果的影響。
　　方法：1.通過AutoCAD201064x與Solidworks201064x軟件設計并制作3種脊髓壓

2、迫固定裝置。取健康雄性Wistar大鼠29只編號后通過隨機數(shù)字生成器隨機分成實驗對照組(n=5)、簡單直板壓迫組(simple plate，SP組)(n=8)、彈性橋壓迫組(elastic bridge，EB組)(n=8)；抽屜尾翼鉤型壓迫組(drawer-hook，D-H組)(n=8)。實驗對照組只進行椎板切除術，實驗組分別植入3種壓迫裝置，植入一周后進行拉力拔出實驗，模型制成壓迫6周后進行TUNEL染色觀察細胞凋亡情況。2.取4-6

3、周齡Wistar大鼠(125-150g)雙股骨及脛骨骨髓，通過密度梯度離心法分離單個核細胞，使用內皮系專用培養(yǎng)基EGM-2MV誘導培養(yǎng)，使其分化為內皮祖細胞。倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的生長情況，通過流式細胞術其細胞誘導培養(yǎng)第7天測定細胞表面抗原CD133、CD34、KDR表達情況，并通過熒光供聚焦顯微鏡觀察細胞攝取Dil-acLDL與結合FITC-UEA-1能力，從功能學方面進一步鑒定誘導培養(yǎng)后的細胞為血管內皮祖細胞。3.15只已制作成

4、功的大鼠慢性脊髓壓迫模型壓迫6周后隨機分為模型對照組(n=5)、單純減壓組(n=5)和減壓聯(lián)合EPCs注射組(n=5)，進行BBB評分后進行減壓并拆除裝置。減壓聯(lián)合EPCs注射組減壓后立即給予細胞量為105的EPCs(10u)進行局部注射，單純減壓組給予PBS10u局部注射。觀察4周后在進行BBB評分，并且取脊髓標本進行ChAT熒光染色，進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：1.從X線觀察中3組裝置植入1周后SP與D-H無明顯脫位，EB組裝

5、置尾端向后脫位。拉力測定顯示在裝置拔出植入后樣本5mm范圍內D-H拉力最大值為245.4±12.83，SP組和EB組分別為7.67±0.70和25.77±21.55對進行方差分析，組間有顯著差異(P<0.05)。D-H在拔出過程中出現(xiàn)拉力突越現(xiàn)象。壓迫6周后進行TUNEL染色顯示3組壓迫模型產生的陽性細胞數(shù)目均有顯著差異(P<0.05)。2.通過細胞形態(tài)變化的觀察、流式細胞術在培養(yǎng)第7天對表面抗原CD133，CD34和KDR的檢測，表達

6、分別為57.5％、11.4％和19.2％，和鑒定細胞功能的雙吞實驗證實本實驗分離和經過EGM-2MV誘導培養(yǎng)所獲細胞為大鼠骨髓內皮祖細胞。3.減壓4周后單純減壓組和減壓聯(lián)合EPCs注射組與減壓前BBB評分都較減壓時都有顯著差異(P<0.05)，兩組模型減壓4周后與減壓前BBB評分差異各有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。模型對照組的ChAT陽性細胞數(shù)目為4.4±1.67，單純給予減壓后4周ChAT陽性細胞數(shù)目為7.0±1.22，給予減壓聯(lián)合E