凋亡誘導(dǎo)因子在腎癌中表達(dá)下調(diào)的機制及其功能研究.pdf

1、腎癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，近年來我國腎癌發(fā)病率、死亡率呈現(xiàn)逐年增長的趨勢，在發(fā)達(dá)地區(qū)表現(xiàn)的尤為明顯。由于腎癌對放化療不敏感，因此對腎癌的治療通常采用手術(shù)直接切除的辦法。目前約30％的腎癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)生了癌癥的轉(zhuǎn)移，進(jìn)入腎癌的晚期，錯過了手術(shù)治療的最佳時期。早期腎癌患者的五年存活率約96%，而晚期腎癌患者的五年存活率僅約20%。目前對腎癌分子生物學(xué)機制的研究認(rèn)為VHL（Von Hippel-Lindau）基因功能異常是腎癌發(fā)

2、生的關(guān)鍵步驟，但同時也發(fā)現(xiàn)VHL基因功能異常并不直接造成腎癌發(fā)生，提示在腎癌發(fā)生過程中存在其它重要的分子事件。
　　凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor，AIF）是定位于X染色體的重要基因，目前認(rèn)為AIF具有雙重功能：在正常細(xì)胞生理活動中通過NADH氧化還原酶活性清除氧自由基，維持氧化呼吸鏈的完整并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換；在細(xì)胞受到凋亡信號刺激時自線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞核，依賴其 DNA結(jié)合能力，與相互作用蛋白

3、形成復(fù)合物降解核酸，促進(jìn)細(xì)胞程序性死亡。
　　本文在實驗室前期工作基礎(chǔ)上，探討了AIF在腎癌中的表達(dá)情況、分子機制、相互作用分子以及對腎癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為腎癌分子機制和腎癌治療的研究提供新的線索。在研究過程中，首先利用多種實驗技術(shù)證明了AIF在腎癌中的表達(dá)下調(diào)具有顯著性和頻發(fā)性。在基于Northern Blot原理的癌癥表達(dá)譜陣列分析實驗中，以AIF cDNA為探針檢測19種組織類型的154對癌和癌旁樣品中AIF mR

4、NA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AIF在正常腎組織中表達(dá)最高，而在腎癌組織中具有顯著的表達(dá)下調(diào)，在其它類型的癌癥中未見AIF如此明顯的表達(dá)差異；利用免疫印跡實驗檢測腎透明細(xì)胞癌及癌旁樣品，發(fā)現(xiàn)85%（17/20）的腎透明細(xì)胞癌樣品中存在AIF表達(dá)水平的顯著下調(diào)；在免疫組化實驗中，84%（43/51）的腎癌組織中呈現(xiàn)AIF表達(dá)的顯著性下調(diào)，而在癌旁組織樣品中具有高水平AIF表達(dá)，并集中分布于近曲小管。這一系列實驗結(jié)果充分說明AIF在腎癌中的表達(dá)下調(diào)具

5、有顯著性和普遍性。根據(jù)AIF在正常腎組織近曲小管中高表達(dá)但在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，并結(jié)合腎癌起源于腎小管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的事實，提示AIF與腎癌發(fā)生有著重要的聯(lián)系。
　　在進(jìn)一步探討AIF在腎癌中表達(dá)下調(diào)的機制時發(fā)現(xiàn)，其分子機制分為遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)兩個層面。在一組確定了AIF表達(dá)下調(diào)的腎癌組織樣品中，采用Southern Blot雜交檢測 AIF在癌癥和癌旁組織基因組中的突變，發(fā)現(xiàn)在11對樣品中有3例的腎癌組織基因組存在AI

6、F3′-UTR部分缺失；采用熒光原位雜交檢測另外11對AIF低表達(dá)腎癌臨床樣本，發(fā)現(xiàn)有2例存在AIF缺失。在AIF啟動子區(qū)DNA甲基化分析實驗中，在4例無AIF基因缺失，同時AIF表達(dá)下調(diào)的男性腎癌病例中，發(fā)現(xiàn)癌癥組織中AIF啟動子區(qū)均有一定程度的甲基化，其甲基化類型包括少量CpG甲基化和大量非 CpG甲基化，而癌旁組織中未發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象；對腎癌細(xì)胞系Caki-1的檢測同樣發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄起始位點下游存在一個頻發(fā)的CpT甲基化位點；在Caki-

7、1細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DNA甲基化酶抑制劑可以提高Caki-1細(xì)胞中AIF的表達(dá)水平。上述結(jié)果說明AIF在腎癌中的表達(dá)抑制的機制包括AIF基因水平的缺失和AIF啟動子區(qū)DNA異常甲基化。
　　AIF在腎癌細(xì)胞中的功能不但與其表達(dá)水平相關(guān)，還與其在腎癌細(xì)胞特定狀態(tài)下的相互作用因子具有直接的關(guān)系。在本研究中通過 GST pull-down實驗發(fā)現(xiàn)了若干AIF在腎癌細(xì)胞中的潛在相互作用蛋白，并利用免疫共沉淀實驗確認(rèn)了其中AIF與STK3的相

8、互作用。STK3是Hippo信號通路中的核心蛋白，也與FOXO和RASSF1A具有相互作用，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。
　　為了解AIF在腎癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，本研究在腎癌細(xì)胞中過表達(dá)AIF，發(fā)現(xiàn) STK3蛋白的磷酸化水平伴隨 AIF的表達(dá)逐漸升高，而細(xì)胞內(nèi)總體 STK3的表達(dá)水平基本維持不變；AIF過表達(dá)的腎癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24小時內(nèi)大量死亡；在AIF的亞細(xì)胞定位分析中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AIF的凋亡腎癌細(xì)胞中發(fā)生了AIF核轉(zhuǎn)位。這些實

9、驗結(jié)果說明了AIF在腎細(xì)胞中功能的復(fù)雜性，盡管AIF在正常腎組織中高表達(dá)，但在腎癌細(xì)胞中高表達(dá)的AIF足以誘導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡，這一過程涉及AIF和多個細(xì)胞信號通路相互作用，以上事實為AIF的功能研究和腎癌的治療提供了新的實驗依據(jù)。
　　綜上所述，通過以上對 AIF在腎癌中的表達(dá)下調(diào)和機制的分析，AIF的相互作用蛋白及在腎癌中的功能研究，表明AIF在腎組織中的表達(dá)和功能具有特異性，在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要作用。對AIF的深