RASGRF1在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)及其機(jī)制和功能的研究.pdf

1、第一章：結(jié)腸癌組織中RASGRF1的表達(dá)和甲基化檢測
　　目的：
　　探討RAS GRF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)和甲基化情況及其與臨床病理的關(guān)系。
　　方法：
　　采用免疫組織化學(xué)和甲基化特異性PCR(MSP)檢測結(jié)腸癌組織及其對應(yīng)的遠(yuǎn)離結(jié)腸癌的正常組織RASGRF1蛋白表達(dá)情況和甲基化狀態(tài)，分析RASGRF1蛋白的表達(dá)和啟動子甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.在結(jié)腸癌組織中RASGRF

2、1蛋白陽性表達(dá)率(36.8％)明顯低于其對應(yīng)的遠(yuǎn)端正常組織(91.2％)，其蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05);與性別、年齡、腫瘤大小和分化程度無關(guān)(P＞0.05)。
　　2.在結(jié)腸癌組織中RASGRF1基因甲基化比例(70.6％)明顯高于其對應(yīng)的遠(yuǎn)端正常組織(17.6％)，其甲基化程度與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05);與性別、年齡、腫瘤大小和分化程度無關(guān)(P＞0.05)。

3、
　　3.RASGRF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與基因啟動子甲基化呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.RASGRF1在結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)與該基因啟動子甲基化呈負(fù)相關(guān)，DNA甲基化可能是結(jié)腸癌RASGRF1表達(dá)下調(diào)的原因之一。
　　2.RASGRF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及甲基化與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)和甲基化可能參與結(jié)腸黏膜的惡性轉(zhuǎn)變，在結(jié)腸癌浸潤轉(zhuǎn)移中起一定的作用。

4、r>　　第二章：結(jié)腸癌細(xì)胞中RASGRF1的表達(dá)和甲基化檢測及其過表達(dá)細(xì)胞模型的建立
　　目的：
　　探討RASGRF1在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)和甲基化情況，篩選適合的細(xì)胞株建立體外RASGRF1過表達(dá)細(xì)胞模型并對其進(jìn)行驗證。
　　方法：
　　采用RT-PCR、Western Blot和MSP檢測人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29、HCT116、SW480和SW620中RASGRF1mRNA和蛋白的表達(dá)情況及甲基化狀態(tài);利用

5、不同濃度的5-Aza-CdR處理結(jié)腸癌細(xì)胞，RT-PCR檢測處理前后RASGRF1 mRNA水平的表達(dá)變化;篩選出適合的細(xì)胞株建立體外RASGRF1過表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞模型;將RASGRF1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染篩選出來的結(jié)腸癌細(xì)胞株，使結(jié)腸癌細(xì)胞高表達(dá)RASGRF1，并運用Real-time qPCR和Western Blot進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果：
　　1.RASGRF1 mRNA在人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中表達(dá)最高，HT29、SW6

6、20次之，而在HCT116中表達(dá)最低。
　　2.RASGRF1蛋白在人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中表達(dá)最高，而在HT29、HCT116和SW620中表達(dá)均明顯下調(diào)。
　　3.RASGRF1基因啟動子在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29、HCT116、SW480和SW620中均存在不同程度的高甲基化，其中以HCT116甲基化程度最高。
　　4.經(jīng)過5-Aza-CdR處理后，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中RASGRF1基因表達(dá)增高。
　　

7、5.選擇HCT116細(xì)胞成功建立體外RASGRF1過表達(dá)細(xì)胞模型(pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO-RASGRF1)。
　　結(jié)論：
　　1、RASGRF1mRNA和蛋白的表達(dá)在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中均明顯下調(diào)，且RASGRF1基因啟動子在結(jié)腸癌細(xì)胞株中存在高甲基化;5-Aza-CdR能上調(diào)RASGRF1的表達(dá)。
　　2、HCT116細(xì)胞適于構(gòu)建體外RASGRF1過表達(dá)細(xì)胞模型。pcDNA3.2/V5/GW

8、/D-TOPO-RASGRF1能有效地轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，使HCT116細(xì)胞中的RASGRF1高表達(dá)。
　　第三章：RASGRF1過表達(dá)對HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究
　　目的：
　　探討RASGRF1過表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。
　　方法：
　　實驗分為兩組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO-RASGRF1的過表達(dá)組和轉(zhuǎn)染空載體pcDNA

9、3.2/V5/GW/D-TOPO的空白對照組。采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況;Transwell細(xì)胞侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力;劃痕實驗和Transwell細(xì)胞遷移實驗檢測細(xì)胞遷移能力;Western Blot法分析RASGRF1過表達(dá)對EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物fibronectin，vimentin蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.M

10、TT結(jié)果顯示，與空白對照組比較，過表達(dá)組可有效抑制HCT116細(xì)胞的生長和增殖能力(P＜0.05)。
　　2.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，空白對照組和過表達(dá)組HCT116細(xì)胞的早期調(diào)亡率分別為3.68±0.26％和4.18±0.25％;晚期凋亡率分別為23.90±0.38％和24.68±0.82％。過表達(dá)組與空白對照組相比，其早期和晚期凋亡率均無明顯差異(P＞0.05)。
　　3.Transwe

11、ll細(xì)胞侵襲實驗顯示，過表達(dá)組HCT116細(xì)胞穿膜數(shù)顯著少于空白對照組（32.2±2.3 vs.48.9±2.2）(P＜0.01)。
　　4.劃痕實驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，過表達(dá)組HCT116細(xì)胞愈合能力明顯減低;Transwell細(xì)胞遷移實驗進(jìn)一步證實，過表達(dá)組HCT116細(xì)胞穿膜數(shù)顯著少于空白對照組(41.1±5.3 vs.66.8±5.5)(P＜0.01)。
　　5.Western Blot結(jié)果顯示，與空白對照組

12、比較，過表達(dá)組E-cadherin蛋白的表達(dá)上調(diào)，而fibronectin，vimentin蛋白的表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　1.RASGRF1過表達(dá)可抑制HCT116細(xì)胞的生長和增殖，降低HCT116細(xì)胞的侵襲遷移能力，而對HCT116細(xì)胞的凋亡無明顯影響，RASGRF1可能在調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵性作用。
　　2.RASGRF1過表達(dá)可上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，抑制fibronectin，vime