FIP200在ATRA誘導NSCs自噬、分化和凋亡過程中表達的研究.pdf

1、目的：
　　本課題通過采用從小到大不同濃度ATRA誘導培養(yǎng)小鼠NCSs，研究在此條件下細胞發(fā)生自噬、分化和凋亡過程當中FIP200蛋白和它的相互作用蛋白的表達水平改變，來初步證實維甲酸是通過影響FIP200的蛋白表達水平來對神經(jīng)干細胞不同生物過程進行調(diào)控的，同時研究自噬分別與分化和凋亡的關(guān)系，從而為進一步揭示維甲酸對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的影響提供依據(jù)。
　　方法：
　　從孕14.5天C57BL/6J小鼠胎鼠中分離得到大腦組織進

2、行提取細胞為NSCs，通過光學顯微鏡下觀察及分化后的免疫熒光染色鑒定。第三代神經(jīng)干細胞分別加入不同濃度大小的ATRA（0、0.1、0.5、1、5、10、15、20μM）誘導培養(yǎng)24h，吖啶橙（AO染色）計數(shù)自噬發(fā)生率，為檢測LC3-Ⅱ，用RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測FIP200和p53基因蛋白的表達水平，研究維甲酸對神經(jīng)干細胞FIP200和自噬水平變化的作用。加入較低濃度的ATRA（0、0.1、0.5、1、5μM）誘導7天，運用細胞

3、免疫熒光法及蛋白質(zhì)印跡法檢測各組分化率，加入自噬抑制劑LY294002后，檢測1μM ATRA誘導NSCs的分化率變化，研究ATRA誘導NSCs分化與自噬的關(guān)系；以及蛋白質(zhì)印跡法檢測RB1表達水平。加入較高濃度的ATRA（5、10、15、20、40μM）誘導培養(yǎng)24h，運用流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)干細胞的凋亡率，再次運用RT-PCR法和蛋白質(zhì)印跡法技術(shù)檢測此5組FIP200蛋白的表達水平，加入自噬抑制劑后比較凋亡率的變化，研究ATRA誘導NS

4、Cs凋亡與自噬的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　(1)胎鼠大腦組織中可以提取出NSCs，鏡下觀察呈圓球狀生長，細胞分化熒光鑒定結(jié)果得以再次證實。
　　(2)不同濃度維甲酸誘導神經(jīng)干細胞，F(xiàn)IP200蛋白和自噬水平是先增高后下降的趨勢，P53則相反。
　　(3)低濃度的維甲酸誘導神經(jīng)干細胞分化與FIP200表達成正相關(guān)，抑制自噬不能抑制分化，分化與RB1有關(guān)。
　　(4)高濃度的維甲酸誘導神經(jīng)干細胞凋亡與FIP200