18647.mitofilin蛋白下調(diào)誘導細胞凋亡的機制研究

1、Mitofilin蛋白下調(diào)蛋白下調(diào)誘導誘導細胞凋亡細胞凋亡的機制研究機制研究StudyontheMechanismofCellApoptosisInducedbyDownregulationMitofilin學科專業(yè)：制藥工程研究生：王珊指導教師：楊曉明教授天津大學化工學院二零一二年五月摘要Mitofilin是線粒體重要的內(nèi)膜嵴形態(tài)維持蛋白，干涉Mitofilin的表達，細胞凋亡增加，但對其影響凋亡的具體機制稍不明確。本研究以此為切入點

2、，進行了對其下調(diào)誘導細胞凋亡的機制研究。本論文首先對Mitofilin的功能進行了研究，構(gòu)建了Mitofilin的慢病毒干涉載體，并且獲得了干涉Mitofilin的穩(wěn)定細胞株。在此基礎(chǔ)上，通過間接免疫熒光技術(shù)，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，透射電子顯微鏡觀察線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)變化，并且利用特異性染料標記細胞內(nèi)分子，流式細胞術(shù)檢測線粒體功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Mitofilin的表達，線粒體功能損傷。進一步檢測了Mitofilin蛋白下調(diào)介

3、導的細胞行為學效應(yīng)。正常條件下，下調(diào)Mitofilin的表達，細胞凋亡比例增加。本實驗利用依托泊苷(10μgmL)誘導細胞凋亡，檢測了過表達和干涉Mitofilin細胞凋亡變化。實驗室前期通過酵母雙雜交陣列篩選和GST沉降技術(shù)發(fā)現(xiàn)Mitofilin和Tim23存在蛋白質(zhì)相互作用。本研究通過外源和內(nèi)源免疫共沉淀證實Mitofilin與Tim23存在相互作用。進一步構(gòu)建了Mitofilin和Tim23的截短體，并且通過GST沉降實驗確定了兩

4、者相互作用的區(qū)段。本實驗進一步檢測了回轉(zhuǎn)Tim23及其相應(yīng)缺失體后，細胞凋亡的變化情況，并且利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實驗檢測了Mitofilin對Tim23穩(wěn)定性的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，過表達Mitofilin可以減少依托泊苷刺激下的細胞凋亡，并有效抑制Tim23的降解；相反，干涉Mitofilin可以加快細胞凋亡進程，加速Tim23的降解，但是體系中回轉(zhuǎn)Tim23，凋亡比例有所下降，而回轉(zhuǎn)Tim23的缺失體后，細胞凋亡無明顯變化。綜上所述，我們得出