差速離心法分離培養(yǎng)人內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及OPN-MMP9在細(xì)胞中的表達(dá)和意義.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 室溫酶解結(jié)合差速離心法分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及評(píng)估
　　目的：
　　探索室溫酶解消化結(jié)合改良式差速離心法在分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的可行性，為進(jìn)一步探索子宮內(nèi)膜藥物干預(yù)時(shí)機(jī)的選擇提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.收集子宮腺肌癥患者的子宮內(nèi)膜標(biāo)本,所得內(nèi)膜分為兩份，一份采用室溫酶解結(jié)合改良式差速離心法（改良組）分離，一份采用37℃水浴消化結(jié)合篩網(wǎng)法（對(duì)照組）分離

2、，并用光鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)圖像分析進(jìn)行細(xì)胞鑒定、純度分析,分別比較兩種方法分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的數(shù)目、純度。
　　2.應(yīng)用光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用四甲基偶氮哩法(MTT)測(cè)定細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果:
　　1．改良組每1g內(nèi)膜組織可得到(9±1.7)×107/mL個(gè)腺上皮細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)角蛋白表達(dá)陽(yáng)性，純度達(dá)（97.8±0.002％；對(duì)照組可得到(3.9±0.78)×107個(gè)腺上皮細(xì)胞

3、，角蛋白表達(dá)陽(yáng)性，純度達(dá)（88.6±0.006%,改良組分離的腺上皮細(xì)胞數(shù)量和純度均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。培養(yǎng)無(wú)一例發(fā)生污染。
　　2．光鏡下觀察,兩組EEC外觀特征相似,細(xì)胞形態(tài)無(wú)差異，兩組細(xì)胞生長(zhǎng)周期有顯著性差異，改良組細(xì)胞于15天開(kāi)始衰退，而對(duì)照組細(xì)胞于8-10天開(kāi)始衰退。
　　3．MTT結(jié)果顯示兩組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的OD450值在3～7d隨時(shí)間增加而升高。接種培養(yǎng)的兩組細(xì)胞均于第3天貼壁完全,且兩組之間OD

4、3值差異無(wú)顯著性；兩組細(xì)胞于第6天開(kāi)始，改良組OD450明顯高于對(duì)照組OD450(P<0.01),即改良組分離得到的腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及活性明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），差異有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　1．單酶消化結(jié)合改良差速離心法能獲得高純度、數(shù)量多的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞。
　　2．初步了解了原代培養(yǎng)的EEC的最佳生長(zhǎng)時(shí)間為6-8天,為藥物干預(yù)時(shí)間的選擇提供了可靠地依據(jù)。
　　第二部分 OPN/MMP9在

5、分離培養(yǎng)的子宮腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義
　　目的：
　　檢測(cè)骨橋蛋白/MMP9在分離培養(yǎng)的子宮腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)的特點(diǎn)，探討骨橋蛋白/MMP-9在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)意義。
　　方法：
　　1.選擇10例子宮腺肌癥患者作為實(shí)驗(yàn)組，6例子宮肌瘤患者作為對(duì)照組，通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)，采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)分析OPN/MMP-9mRNA在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組子

6、宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的表達(dá)。
　　2.收集分離培養(yǎng)的不同時(shí)間的子宮腺肌癥患者內(nèi)膜上皮細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR)檢測(cè)OPN/MMP-9mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.OPNmRNA在培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組腺上皮細(xì)胞OPNmRNA的表達(dá)均較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而同一組中增殖期腺上皮細(xì)胞OPNmRNA的表達(dá)與分泌期相比，與月經(jīng)周期無(wú)關(guān)

7、，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）
　　2.MMP-9mRNA在培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)組腺上皮細(xì)胞OPNmRNA的表達(dá)均較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而同一組中增殖期腺上皮細(xì)胞MMP-9mRNA的表達(dá)與分泌期相比，分泌期顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.OPN/MMP-9mRNA在分離的子宮腺肌癥內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間的表達(dá)：腺上皮細(xì)胞在分離培養(yǎng)的第7、8、9天，OP

8、N/MMMP-9mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；腺上皮細(xì)胞在分離培養(yǎng)的第7天，與分離培養(yǎng)的第3、12天相比，第7天OPN/MMMP-9mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1．OPNmRNA在子宮腺肌病內(nèi)膜上皮細(xì)胞中高表達(dá)，但與所分離的內(nèi)膜不同月經(jīng)周期無(wú)關(guān)，無(wú)明顯月經(jīng)周期，MMP-9在子宮腺肌病在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞中分泌期高表達(dá)，可能與子宮腺肌病的侵襲過(guò)程有關(guān)，兩者在腺肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
　　2．OP